国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第2期

第三军医大学检验系（400038） 李文建解庆华邹全明

摘要一氧化氮（NO）是近年来生物医学界研究的前沿和热点之一。NO合成得过多或不足与许多疾病的发生机制有关。NO含量的检测可能为心血管疾病、败血症休克等的诊断提供依据。吸入NO及使用NO供体、NO生成调节剂等已为一些医学问题的解决提供了帮助，并可能给更多重、危、顽症的治疗带来新的希望和线索。

关键词：一氧化氮 检测 治疗

1NO的研究概况

1986年底，纽约州立大学Furchgott和加州大学洛杉矶分校的Ingarro分别独立地提出内皮细胞舒血管因子endothelium-dreived relaxing factor，EDRF）的本质是NO。1987年，英国Wellcome实验室的Palmer等采用化学发光法比较直接地证明了内皮细胞可以释放NO。

进入90年代，有关NO的研究跨入一个迅猛发展的阶段，1992年，美国《Science》杂志将NO评为该年度的“年度分子”（molecule of the year ）。NO在多个系统的生理病理过程中所起的重要作用不断被阐明，使NO的研究渗入到众多学科，成为生物医学领域的热点和前沿之一。

已研究表明^[1]，NO参与血管和气管平滑肌的舒张、中枢和自律神经的传递、细菌的杀伤、肿瘤细胞的融解、内分泌激的释放、机体免疫防御、吸收功能的调节等。NO是机体内重要的信使分子、效应分子和免疫调节分子的观点，已为学术界所广泛接受。1998年，Furchgott，Ignarro和Murasd三人作为“NO能在心血在管系统中充当信号分子”的发现者而荣获该年度诺贝尔生理及医学奖。

2NO检测在实验诊断中的应用

2.1NO合成及生物学作用^[2]内源性NO是由NO合酶（nitric oxide synthase ，NOS）催化L-精氨酸（L-Arg）末端胍基中的一个氨原子氧化而生成。

NO的合成受多种因素的影响。NOS是NO合成的关键酶，根据其存在的部位及作用机制的差异，分为固有型（constitutive nOS，cNOS）和诱导型(inducive NOS，iNOS)两类。cNOS驻要存在于内皮细胞（又称内皮型NOS，endothelial nOS，eNOS）及神经细胞（又称神经元型NOS，neuronal NOS，nNOS）内，为Ca²⁺/钙调素依赖型，合成及释放NO量少（pM），cNOS的激活剂有乙酰胆碱、谷氨酸盐、纤维蛋白酶、Ca²⁺等；iNOS为非Ca²⁺依赖型，存在于几乎所有的组织细胞中，巨噬细胞和血管平滑肌细胞内含量最多，能够持续大量释放NO（nM），多种细胞因子如α-INF、IL-1、TNF-α、LPS等均可诱导iNOS生成。还原型辅酶Ⅱ及O₂是NO合成的辅底物，黄素腺嘌呤二酸（FAD）、黄素单核酸（FMN）、四氢喋呤（BH₄）、亚铁血红素是NOS的辅基，直接影响NO的合成；另外，L-Arg类似物如N^G-甲基-L-精氨酸（L-NMMA）、N^G-硝基-L-精氨酸（L-NAMA）、N-亚胺基乙基-L-鸟氨酸（L-NIO）、N^G-硝基-L-精氨酸(L-NNA)及N^G，N^G-二甲基精氨酸（DMA）均证明有内源性形式存在，可抑制NO的生成。目前，两类NOS在人及鼠类（Rat）染色体上的位置已经明确，故对NOS活性的调控研究已可以上升到基因水平。

NO是一种活性很强的自由基，还具有氧化还原特性，体内半衰期仅3～5s。NO生物效应主要通过靶细胞膜上的受体介导，推测受体可能为酶或酶分子中的Fe²⁺、铁卟啉或者血红素。NO与受体结合后，激活靶细胞膜上的鸟苷酸环化酶（GC）进而使cGMP合成增加并发挥第二信使的作用，如降低胞内游离钙、扩张血管，抑制血小板聚集和粘附、松驰气道平滑肌等，作用于神经细胞和免疫细胞还发挥神经传导和免疫调节作用。但是过量的NO可灭活三羧酸循环的乌头酸酶、线粒体逆电子体系中的NDAPH脱氢酶和琥珀酸脱氢酶，从而抑制能量合成；过量NO还抑制核糖核苷还原酶而影响DNA复制；尤其是NO与超氧化物离子（O₂^-）结合或与血红蛋白反应生成过氧亚硝酸根（ONOO^-），后者还可继续分解为NO₂等自由基，NO₂自由基和ONOO^-对组织细胞具有直接损伤作用。

2.2NO的检测方法由于NO在生物体内含量低，半衰期短，有O₂存在条件下极易被氧化，这就给其准确测定带来困难。目前主要采用测定NO的稳定代谢终产物NO₂^-、NO₃^-间接反映NO含量的方法。NO₃^-可用硝酸盐还原酶或镀铜法将其还原为NO₂^-，再与Griess试剂发生重氮化反应，生成橙红色化合物，λmax＝546nm，呈色强度与NO₂^-浓度成正比。化学发光法^[3]根据NO可与臭氧(O₃)发生化学反应形成激发态二氧化氮(NO₂)，后者在返回基态过程中释放能量，部分能量以光子形式发射，利用敏感的光电倍增管来检测光子的发射强度，以此推算NO含量。此法具有高灵敏度和高特异性的优点，尤其适用于呼出气NO含量的检测。但由于存在金属，玻璃，塑料等因素的干扰作用，其临床应用受以一定限制。其它还有高效色谱法，高铁血红素法等，由于需要特殊仪器，操作繁杂，难于在临床推广使用。Griess试剂法测定NO₂^-灵敏度高，线性好，不需特殊仪器，操作也较简便，适于临床推广使用，也是目前NO研究中应用最广泛的方法。我室研制的一氧化氮(NO)检测试剂盒(单一试剂法)^[4]经数位研究人员试用和在国内数家医院推广使用，效果良好。

2.3NO合成减少与疾病的关系

2.3.1NO合成不足引起高血压、动脉粥样硬化等血管疾病^[6]。健全的血管内皮细胞是维持血管张力、调节血压的基础，基础状态下血管阻力由NO(这里又称皮内细胞舒血管因子，EDRF)控制。长期NO合成不足不仅不能有效扩张血管，还加剧了内皮素(ET)的缩血管作用，使血压升高；NO相对缺乏导致抑制肾素作用下降，抑制平滑肌增生和血小板粘附与聚集能力下降，促进高血压的维持及血栓的形成；长期高盐饮食，NO合成不足，压力-利钠反射减弱，不能有效地利纳、利尿，从而出现高盐引起的高血压。高胆固醇或高脂血症时，内皮细胞内L-Arg生物利用率下降，NOS对L-Arg亲和力下降，同时内皮细胞合成和释放NO₂增多，灭活NO加快，特别是氧化脂蛋白更易灭活NO，NO受体信号传递受抑制，NO功能不能得到发挥，不仅使血管收缩，还促进平滑肌增生和激活巨噬细胞与内皮细胞粘附，诱导泡沫细胞形成，促进血小板粘附与集聚，最终导致粥样硬化病变。

2.3.2慢性病毒性肝炎人NO(血清NO₂^-)合成减少^[5]，推测肝炎病毒可能抑制NO合成，从而影响机体的免疫防御。

2.3.3 吸烟可以导致血浆NO(NO₂^-/ nO₃^-)浓度降低，并与心、脑及外周血管性疾病发病有关，是动脉粥样硬化及血栓形成的一个主要危险因素。停止吸烟可以使血浆NO浓度增加，且减少心血管疾病的发生率^[7]。

2.3.4孕妇血中NO水平下降是妊娠高血压综合征发病的一个重要环节。但有作者报道^[8]，妊高征NO水平同于甚至高于正常妊妇。因前者尿NO₂^-/NO₃^-与血浆肌酐之比降低，推测为肾功能受损，对NO₂^-/NO₃^-排泄能力降低所致。

2.3.5有些药物如环孢菌素、造影剂、嘌呤霉素、甘油等所致急性肾衰与机体L-Arg相对缺乏或（和）内源性NO不合成不足有关^[9]。

2.4NO合成亢进与疾病的关系

2.4.1细菌内毒素(脂多糖，LPS)和炎症细胞因子刺激的NO过度产生为败血症性休克病理发生过程中关键性的中介机制^[10]。NO合成亢进，使血管阻力下降，而心搏输出正常或增加，因此引起的休克为低阻高排型。病原体直接侵入血流或全身性释放内毒素和外毒素，启动了败血症的一系列反应。内毒素触发巨噬细胞，T淋巴细胞一些中介物质如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2等，这些炎性细胞因子诱导血管平滑肌及组织巨噬细胞iNOS过度表达，由此大量产生NO，一方面松驰血管平滑肌，另一方面产生细胞毒性而损伤组织。

2.4.2呼吸道因过敏反应产生的IgE介导呼吸道上皮细胞及炎症细胞合成过NO导致炎症介质释放^[11]。NO产生过多，虽可松驰和扩张气管平滑肌，但更重要是扩张血管，增加气道内诱出，并能损伤上皮细胞，因此最终结果是引发气道炎症和气道狭窄，导致哮喘病的发生。

2.4.3结缔组织可由于其炎症细胞、血管内皮细胞、软骨细胞等合成NO亢进，过多NO不仅破坏软骨细胞，还降解透明质酸酶而导致系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等疾病^[12]。

2.4.4其它如肝硬化病人因NO合成过多，使体循环门脉系统血管阻力下降，血压降低，门体循环分流而致门静脉高压。Soderman^[13]发现，肝功能不全患者过多NO可由呼吸道排出，这将有助于了解肝病患者血管扩张的病理生理机制。另外，胰岛内炎症细胞释放NO过多可破坏β细胞而与糖尿病的发生有关^[14]。

3NO在疾病治疗中的应用