国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第6期

白求恩医学大学基础医学院（长春130021）候芳玉 郭焱综述

白求恩医科大学应用基础医学研究所（130021）李才审校

摘要 晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end prodrcts, AGEs）在糖尿病慢性并发症发病中起重要作用。近年来AGEs作为监视伴慢性并发症糖尿病病人治疗效果的一项重要指标，正被认识并在临床应用。本文介绍GAEs的形成过程、化学结构、检测方法和临床意义。

关键词：晚期糖基化终末产物；检测方法；糖尿病

慢性高血糖是诱发糖尿病慢性并发症的始动因素。近年大量研究证明，在高血糖状态下蛋白质发生的非酶糖基化在糖尿病慢性并发症的发病中起重要作用^[1]。血清和组织中晚期糖基化终末产物（AGEs）水平与糖尿病慢性并发症的程度明显相关，阻止糖基化反应可减少AGEs形成，减少或减轻并发症。血清或组织AGEs浓度已作为监视糖尿病，尤其是伴有肾脏损害及血管并发症病人治疗效果的一项新指标^[2]。因此，准确测定血清和组织中AGEs浓度，判断病人体内AGEs蓄积程度具有重要临床意义。

1 非酶糖基化反应

蛋白质非酶糖基化是指在无酶催化条件下，葡萄糖分子游离醛或酮基与蛋白质氨基通过亲核加成反应形成糖基化蛋白的过程。早期形成可逆的Schiff碱，后者经结构重排形成较稳定的酮胺化合物（Amadori产物），再经过脱水、氧化和缩合等反应，最后形成稳定的、不可逆的AGEs。这一反应最早由法国生物化学家Maillard描述，故又称为Maillard反应。除葡萄糖外，其它还原糖类如果糖、葡萄糖-6-磷酸和核糖等也可使蛋白质糖基化。而且由于开链结构的关系，它们使蛋白质糖基化的速度明显比葡萄糖快。一般认为，AGEs常发生在长寿蛋白上，如胶原蛋白和晶体蛋白等。近年证明，AGEs也可在一些短寿蛋白、核酸、脂质成分和脂蛋白上形成^[3]。

2 AGEs的化学结构和共同特点

AGEs呈异质性，分离时不稳定，使AGEs化学结构研究遇到不少困难，迄今AGEs的实际化学结构尚不清楚。体内已被鉴别出来的糖基化产物主要有：2（2-furoyl）-4（5）-（2-furanyl）-1H-imidazole（FFI）alky-formyl-diglycosylpyrrole（AFGP）pyrraline、羧甲基赖氨酸（Carboxy-methyl-lysine, cML）和戊糖苷（pentosidine）。但目前尚无充分证据证明它们就是体内AGEs存在的真实形式。CML系果糖赖氨酸氧化裂解的产物。戊糖苷是一个赖氨酸和一个精氨酸残基与一个咪唑-（4,5b）-吡啶翁环的结合物。有研究证明，CML是抗AGEs抗体识别的主要结构。

虽然AGEs的实际化学结构尚不清楚，且呈异质性，但它们具有至少一个共同的结构成分和共同的抗原决定簇。AGEs的共同特点是，不可逆性，呈棕褐色，具有特征性荧光光谱和同蛋白质等大分子形成交联的能力（交联性）。

3 AGEs的检测方法

由于AGEs化学结构不明和呈多样性，而且无商品试剂盒可供临床使用，因此血清和组织AGEs水平的检测尚有一定困难。检测AGEs的主要方法有：（1）放射免疫分析法。它检测AGEs的灵敏度高，但对抗AGEs抗体纯度的要求很严格；（2）放射受体分析法。本方法的特异性、精确性和重复性均很好，但检测时须用较大量放射性同位素，易造成环境污染，故在普通实验室难以应用；（3）荧光光谱法。AGEs在Ex370/Em440nm有特征性吸收光谱，故荧光光谱分析是测定AGEs较常用的方法，通过荧光测定可大致估计体内AGEs的实际水平，可能与AGEs的变化趋势，但有时会低估AGEs的的实际水平，可能与AGEs的有些结构不具有荧光性质有关。由于体内尚存在其他荧光物质，可能影响AGEs的荧光测定，故荧光光谱法测定AGEs尚缺乏特异性。戊糖苷在Ex338/Em385nm波长下有特征性光谱，可用以测定戊糖苷水平；（4）酶免疫法。本法是近年来发展起来的AGEs检测技术，具有特异性高、精确性好、简便、快速和可在普通实验室应用等优点，已成为目前检测AGEs的常用方法。但抗体制备和分析方法的标准化等问题尚有待提高。以下主要介绍用酶免疫技术检测AGEs的有关问题。

4 测定AGEs的酶免疫技术

4.1 AGE修饰蛋白质（免疫原）的制备 由于AGEs的化学结构尚未阐明，很难获得其真正纯品，因此难以直接用AGEs作为免疫原。目前多使用在体外糖基化体系（含葡萄糖等还原糖和蛋白质）中制备的AGE修饰蛋白质（AGE-Protein）作为免疫原。早年Nakayama等用AGE修饰钥孔血蓝素（Keyhloe limpet hemocyanin, KLH）、牛血清白蛋白（BSA）和核糖核酸酶（RNase）作为免疫原，免疫豚鼠制备出抗AGE多克隆抗体，并证明这些抗体对AGEs的共同抗原决定簇是特异的，而与早期糖基化产物不发生反应。此后，Horiuchi等用AGE修饰BSA（AGE-BSA）作为免疫原，制备了抗AGE多克隆抗体和单克隆抗体。这些抗体与AGE修饰的几种蛋白质均发生反应，而与FFI及pyrraline不发生反应，证明AGEs中确实存在共同结构。但这种共同结构是什么，迄今未被阐明。

已经证明，在多种AGE修饰的蛋白质中，以AGE修饰核糖核酸酶（AGE-Rnase）作为免疫原免疫动物产生和抗体效价高，特异性强^[4]。AGE-Rnase的制备：一般用25mg～45mg rnase与1mol/L葡萄糖溶于0.2mol/L磷酸盐缓冲液（Ph7.4）中，除菌后37℃，暗处孵育90天。制备包被等用的AGE-BSA则用50mgBSA与0.5mol/L，葡萄糖溶于0.2mol/L磷酸盐缓冲液（Ph7.4）中，除菌后37℃，暗处孵育60天^[4]。

4.2 抗AGE多克隆抗体的制备^[4] 由于以AGE修饰蛋白质作免疫原的特殊性，制备抗AGE抗体的方法与一般制备抗体的方法有所不同。AGE-Rnase与完全福氏佐剂等量乳化后，经家兔皮内多点注射，每周1次，共4次。休息2周后，将AGE-Rnase与不完全福氏佐剂等量乳化，加强注射1次。末次注射后10天采血分离血清，检测抗体效价。我们用上述方案制备抗AGE抗体时，基础免疫共进行6次，如强免疫1次，所得抗体效价较理想^[5]。为获得高效价、高亲和力的抗体，所用的抗原要纯，免疫过程不能急于求成。原则上应以小量抗原多次注射，较长时间免疫动物。我们体会，由于免疫过程的长短和动物个体差异等原因，所得抗血清的效价往往相差甚大^[5]。

4.3 用竞争性ELISA检测AGEs 用竞争性ELISA检测血清和组织中AGEs水平是目前最常用的方法。其基本原理是：固相抗原AGEs（AGE-BSA）与待测标本中AGEs竞争地结合有限量的抗体（抗AGE-Rnase抗体），结合到固相上抗体的量与标本中AGEs的量呈逆相关。基本操作步骤是，用AGE-BSA包被酶标测定板，封闭，加入待血清和标准物（AGE-BSA），再加入抗AGE-Rnase抗血清，最后加入碱性磷酸酶（ALP）标记的羊抗兔IgG和酶作用底物，显色后用酶标测定仪测定吸光度。

有人用时间分辨荧光分析法检测血清AGEs浓度。其原理同竞争性ELISA法，只是把ALP的作用底物改为5-氟水杨酸磷酸酯（FSAP），后者在ALP作用下水解为5-氟水杨酸（FSA）。FSA与三价铽（Tb³⁺）形成具有强荧光的三元螯合物，再在时间分辨荧光分析仪上测定其荧光值。

竞争性ELISA也可用于测定循环中血红蛋白-AGE（Hb-AGE）。Hb-AGE是体内组织被AGEs长期修饰的标志，它作为更长期的血糖控制状况的指标比HbAlc更优越^[6]，有可能作为一项新的糖基化指标在临床上应用。

4.4 AGEs的表示单位和标准化 目前使用竞争性ELISA检测AGEs最大的限制是，尚无通用的AGEs表示单位和绝对标准。以往用两种方法定义AGEs单位：一种是AGE-蛋白质浓度法，即1U aGEs等于1μg AGE-BSA的B/Bo＝试验管OD-背景OD（不加抗AGE抗血清）/总OD（不加标准AGE-BSA）-背景OD。另一种是50％抑制法，即将引起抗AGE抗体结合到吸附AGE-蛋白达50％抑制的AGEs量，定义为1U aGEs。这两种表示AGEs单位方法的主要缺陷是，不同批次或不同实验室所测得的AGEs结果难以比较。为克服上述缺陷，Mitsuhashi等^[7]提出用正常人血清（NHS）来标准化AGEs测定。因为NHS中AGEs水平处在狭窄的范围，可用正常人血清平均AGEs值作为通用的AGEs测定标准。NHS法定义的AGEs单位是在竞争性ELISA中等于1：5稀释的NHS引起抑制的量，即NHS中AGEs值被定义为5U/ml。用NHS法定义AGEs单位的优点是，NHS中AGEs是自然形成的。不象前述两种定义方法，此法定义AGEs单位不取决于吸附性抗原和AGE-蛋白质，也不取决于抗AGE抗体。而且这种标准品易于获得，所测得AGEs值在测定批次之间或实验室之间具有可比性。

4.5 抗AGEs单克隆抗体 由于单克隆抗体（单抗）具有高度特异性和均一性，抗AGE单抗可能比抗AGEs多克隆抗体（多抗）优越。然而，由于AGEs呈多样性，其真实化学结构不明，抗AGEs单抗不能识别目前已提到的一些AGEs结构。另外，单抗仅能识别单一抗原位点，进行微量抗原（如AGEs）检测时，其灵敏度往往不如多抗。我们的研究也证明，用AGEs单抗测定血清AGEs时灵敏度不及多抗。但在免疫组织化学研究中，AGEs单抗似优于多抗。

4.6 组织中AGEs定量和定位 应用抗AGEs抗体和竞争性ELISA法可测定组织中AGEs水平，检测前组织标本须进行预处理^[3]。利用抗AGEs单抗或多抗及免疫组织化学方法，可对组织中AGEs的分布进行定位检查。

5 AGEs的致病作用和临床意义

AGEs具有广泛的致病作用。AGEs形成