【摘要】目的探讨角膜碱烧伤后眼局部的免疫反应机制。 方法在大鼠角膜上制作碱烧伤模型。在烧伤后的不同阶段，制备角膜、虹膜组织平片，采用标准的卵白素-生物素过氧化物酶复合物免疫组化(avidin-biotin complex ，ABC)方法，观察眼局部T淋巴细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞、主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）-Ⅱ类抗原阳性细胞的动态变化。结果碱烧伤后早期，角膜及虹膜即有T淋巴细胞浸润，以CD^＋₃淋巴细胞为主，MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞也轻度增多。在角膜溶解穿孔阶段，T淋巴细胞浸润达到高峰，其中CD^＋₄淋巴细胞明显多于CD^＋₈淋巴细胞；巨噬细胞、树突细胞、MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞大量出现。上述细胞密集分布于角膜缘，其中淋巴细胞及MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞可见于角膜溶解处及中央区。在烧伤后期角膜溃疡已进入修复阶段，虹膜上依然可见多量各类阳性细胞。结论免疫反应可能参与了角膜重度碱烧伤后的组织病变过程，在角膜溶解穿孔及眼内炎症的发生中起重要作用。

Immunologic experimental studies on the alkali burn of cornea in rats

ZHAO Min

（Department of Ophthalmology, First Teaching Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016，China）

CHEN Jiaqi, YANG Peizeng.

【Abstract】ObjectiveTo investigate the immune reaction of severe corneal alkali burns. Methods The models of severe corneal alkali burns were induced in rats. Immunohistochemistry was carried out on wholemounts of the cornea and iris at different time points after corneal burns to detect T-lymphocytes and their subpopulation, macrophages, dentritic cells and MHC class Ⅱ-positive cells. Results In the early stage of the burns, there were small increasing number of T-lymphocytes and MHC class Ⅱ-positive cells in the cornea and iris. At the period of corneal melting and perforation, a massive influx of lymphocytes (CD^＋₃, CD^＋₄, CD^＋₈), macrophages and dentritic cells was seen in the cornea adjacent to the limbus and iris. CD^＋₄ lymphocytes were much more than CD^＋₈ in number. T-cells and MHC class Ⅱ-positive cells were observed not only at the limbus but also in the melting area and corneal center. Morphological changes of these cells were also noted. In the restoration stage, a number of positive cells were still found in the iris. ConclusionImmunological mechanism is involved in the pathological changes of the damage induced by corneal alkali burns, especially in the pathogenesis of the corneal melting and perforation.

【Key words】Cornea； Burn, chemical； Models，immunology； Immunohistochemistry； Wholemount

角膜重度碱烧伤后常发生顽固性溃疡，甚至溶解穿孔，在这个病理过程中，免疫学机制是否参与，一直是人们关注的问题；对碱烧伤后是否应用皮质激素治疗也一直存在着争论。为了探讨眼碱烧伤后的免疫反应，我们采用眼组织平片技术，对碱烧伤后的角膜及虹膜组织进行免疫组织化学研究，观察眼局部T淋巴细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞、主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）-Ⅱ类抗原阳性细胞的动态变化。

材料和方法

一、材料

健康SD(sprague dawley)大鼠20只，体重150～200 g，鼠龄6～8周，雌雄各半。

二、方法

采用0.2 ml氨胺酮+0.1 ml氯丙嗪腹腔注射麻醉，将直径5 mm 的圆形滤纸在1 mol/L NaOH中充分浸透，取出滤纸，吸除滤液，贴于角膜中央烧灼30 s；移去滤纸后，立即用生理盐水冲洗结膜囊，以0.5%新霉素眼液滴眼。

1.取组织标本时间：在3个不同时间段取病变组织标本：(1)烧伤早期(2或3 d)；(2)角膜溶解即将穿孔或穿孔初期(7～12 d，平均8.5 d)；(3)溃疡愈合，新生血管生长，病情稳定时的恢复期(均在14 d以上，平均20 d)。

2.标本制作步骤：采用杨培增等^［1，2］所用方法制作眼组织平片。麻醉后，于大鼠左心室内注射10⁶U/L肝素0.3 ml以抗凝血，从左心室插管至主动脉，用250 ml预冷的磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)灌注，充分排除血管床中的血液成分；摘除眼球，在手术显微镜下从睫状体平坦部切开眼球，分离出虹膜、角膜组织，各取4片，移入100%冷乙醇中固定5～10 min，再移入0.01 mol/L PBS液中，4℃贮存备用。免疫组织化学染色采用卵白素-生物素过氧化物酶复合物(avidin-biotin complex, ABC)法。一抗采用小鼠抗大鼠IgG(购自Holland biotechnology公司)，包括抗CD^＋₃、CD^＋₄、CD^＋₈淋巴细胞，树突细胞，巨噬细胞，MHC-II类抗原抗体；二抗采用生物素标记的羊抗小鼠IgG(华美生物制品公司)。眼组织平片ABC法染色主要步骤在24孔培养板中进行；将染色好的组织片平铺于凝胶包被的载玻片上，常规封片；阴性对照以PBS液代替一抗。光镜下观察。

结果

一、正常眼组织平片

正常角膜仅在角膜缘发现少量CD^＋₃淋巴细胞(图1)、呈圆形的MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞及少量可疑的巨噬细胞；正常虹膜上淋巴细胞及MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞稍多，呈散在分布(图2)，可见CD^＋₃、CD^＋₄、CD^＋₈淋巴细胞，CD^＋₄与CD^＋₈淋巴细胞比例大致相当；可见少量巨噬细胞和树突状细胞。

二、碱烧伤后眼组织平片改变

1. 烧伤早期：(1)角膜：角膜缘的淋巴细胞较正常眼增多，以CD^＋₃淋巴细胞为主(图3),可见少量的巨噬细胞及树突状细胞，后者染色较淡；MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞增多，仍以圆形为主。在角膜中央未见上述细胞。(2)虹膜：淋巴细胞、MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞较正常眼明显增多，淋巴细胞仍以CD^＋₃为主，CD^＋₄、CD^＋₈淋巴细胞较少；巨噬细胞与树突状细胞染色加深，数量稍有增加，巨噬细胞以中等大小的圆形细胞为主。

2.角膜溶解穿孔期：(1)角膜：淋巴细胞显著增多,在角膜缘及角膜周边部数量约为烧伤初期的10倍，在角膜溃疡及溶解区，亦可见少至中等量的淋巴细胞,其中以CD^＋₃最多，其次为CD^＋₄和CD^＋₈淋巴细胞；角膜缘可见大量的巨噬细胞和树突状细胞，密集成堆，难以准确计数，用调焦的方法发现这些细胞分布于角膜各层，由角膜缘向角膜中央逐渐减少(图4)；在角膜溶解穿孔附近及角膜缘，可见多量MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞，其形态由烧伤初期的圆形变为多形性(图5)。(2)虹膜：可见大量的CD^＋₃、CD^＋₄及CD^＋₈淋巴细胞(图6)，CD^＋₄淋巴细胞明显多于CD^＋₈；巨噬细胞和树突状细胞在虹膜根部较多，树突状细胞的突起长而粗大且增多(图7)；MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞除数量显著增多外，形态也呈多样性，大小不一(图8)。

3.恢复期：除MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞在角膜缘分布较正常眼增多外，角膜平片其它阳性细胞均逐渐减少；但在虹膜平片上，仍可见大量的CD^＋₃、CD^＋₄及少量的CD^＋₈淋巴细胞，即使在烧伤后30 d，虹膜平片上淋巴细胞及MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞仍显著多于正常对照组。

讨论

一、角膜碱烧伤溃疡溶解的机制

既往研究认为，角膜重度碱烧伤后出现的反复性角膜溃疡、溶解穿孔，其发生机理主要是碱烧伤后胶原酶对角膜胶原的不断消化，以及氧自由基对角膜细胞的毒性破坏。这两个因素都与多形核白细胞的浸润有关。角膜溶解穿孔时正是多形核白细胞浸润的高峰，与此同时淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞也增多,并出现体液免疫反应的高峰，因此有文献报道免疫机制可能参与了眼碱烧伤的病理过程^［3］。但迄今为止，相关的研究很少。

二、眼组织平片免疫组织化学染色技术的优越性

我们采用眼组织平片免疫组织化学染色方法，首次观察了眼部碱烧伤后不同阶段T淋巴细胞亚群、巨噬细胞、树突状细胞、MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞的动态变化。眼组织平片免疫组织化学染色技术是近年问世的一种研究方法^［4］，在对葡萄膜炎动物模型的研究中显示出其独特的优越性^［1,2,4］