【摘要】目的研究T淋巴细胞亚群在复发性单纯疱疹病毒性基质性角膜炎（stromal keratitis，SK）中的作用。方法采用复发性单纯疱疹病毒性SK的NIH鼠模型，应用单克隆抗体GK 1.5、H-35选择性地排除鼠体内的CD^＋₄ 、CD^＋₈ T淋巴细胞后，观察鼠的SK的复发率、临床特征、角膜病理切片及鼠的迟发型超敏反应（delayed-hypersensitivity，DTH）的能力。结果90%以上的CD^＋₄ T淋巴细胞及95%以上的CD^＋₈ T淋巴细胞被排除。CD^＋₄ T淋巴细胞的排除降低了SK的复发率，减轻了SK的疾病程度，损伤了鼠的DTH反应能力。而CD^＋₈ T淋巴细胞的排除对此却无明显影响。SK的角膜病理显示：排除了CD^＋₈ T淋巴细胞的鼠的角膜基质层内可见大量的淋巴细胞和中性粒细胞浸润（类似于对照组角膜病理改变），而排除了CD^＋₄ T淋巴细胞的鼠的角膜基质层内偶见淋巴细胞浸润。结论CD^＋₄ T淋巴细胞是介导复发性单纯疱疹病毒性SK免疫病理反应的主要因子。

An experimental study of immune mediating action of T-lymphocyte subsets on recurrent herpetic stromal keratitis

XIA Likun, SHU Hong, GAO Dianwen.

（Department of Ophthalmology, The Second Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110003，China ）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of T-lymphocyte subsets in the recurrent herpetic stromal keratitis (SK). Methods In a recurrent SK NIH mouse model, rat monoclonal antibodies were used to selectively deplete in vivo the CD^＋₄ and CD^＋₈ T-lymphocytes in mice, and the effects of the subsets on recurrent herpetic SK were evaluated. ResultsAs measured by flow cytometry, in the mice treated with GK1.5, ＞90% of CD^＋₄ T cells were depleted; and in the mice treated with H-35, ＞95% of CD^＋₈ T cells were depleted. Depletion of CD^＋₄ T cells could halt the recurrence of SK, reduce the severity of recurrent SK and impair the delayed type hypersensitivity. In contrast, depletion of CD^＋₈ T cells had no effect on the outcome of the disease. Histopathologic examination of the recurrent SK demonstrated that the stromal inflammation in CD^＋₈T-cell depleted and control mice was characterized by extensive lymphocyte and polymorphonuclear leukocyte infiltration, but only occasional lymphocytes were observed in CD^＋₄ T-cell depleted mice. ConclusionThe results provide evidence that recurrent herpetic SK represents an immunopathologic process mediated by CD^＋₄ T cells.

【Key words】 Eye infections, viral； T-lymphocytes

单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV-1）引起的基质性角膜炎（stromal keratitis，SK）是人类主要的致盲性眼病之一，其主要原因在于HSV-1的潜伏感染和反复激活，引起SK的反复发作、角膜基质混浊的反复加重，最终造成角膜白斑而致盲。SK的发病机制尚不清楚。以往的研究表明，复发性单纯疱疹病毒性SK是一种由HSV-1抗原引起的由T淋巴细胞介导的免疫病理性疾病^［1-3］。但是，这些研究均采用的是原发性病毒性角膜炎的动物模型，这种动物模型缺少人类复发性SK的许多特征^［4］。 因此，我们改进了由Shimeld等^［5,6］建立的鼠的复发性SK的模型，并应用单克隆抗体选择性地排除了鼠的CD^＋₄、CD^＋₈T淋巴细胞，以期观察CD^＋₄、CD^＋₈T 淋巴细胞的排除对SK的复发率及疾病程度的影响，同时对其发病机制进行探讨。

材料与方法

一、动物模型的制备

1.病毒和细胞：病毒为隔离的人的高神经毒力的HSV-1 Mckrae毒株（美国华盛顿大学眼科中心提供），使用前滴度为2.2×10⁹空斑单位（plague forming unit，PFU）/ml。生产和检测病毒的细胞为非洲绿猴肾细胞。培养非洲绿猴肾细胞的营养液为含5%胎牛血清、青霉素（1×10⁵ U/L）及链霉素（0.1 g/L）改进的最小基础培养基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM，美国Gibco Grand Island公司提供）。

2.鼠和角膜感染的程序：（1） 动物：选用4～6周，体重为18～22g的雌性NIH鼠（英国Harlan Olac Ltd公司提供）130只作为实验对象。其中100只鼠的角膜接种HSV-1，另30只为空白对照。（2）方法：实验鼠麻醉后置于显微镜下，用25号刀片交叉划伤鼠右眼角膜上皮层呈“≡”字形；将5 μl含有1×10⁶ PFU病毒的DMEM滴于右眼角膜表面，同时向鼠的腹腔内注射人的抗病毒血清1 ml（美国Chemicon公司提供，该血清中和HSV-1的半数有效剂量为1/640），使病毒潜伏于三叉神经节或角膜内而角膜恢复透明，限制病毒感染外周组织使鼠100%存活；3 d后，用蘸有DMEM的湿棉签擦拭右眼角膜，然后将棉签置入装有1 ml DMEM的试管中，用非洲绿猴肾细胞的细胞培养检测擦拭液中有无病毒存在；并于接种后第3天及1周时，在裂隙灯显微镜下检查角膜情况。除外无树枝状、地图状角膜炎或棉签擦拭液中未检测出病毒的鼠，余鼠继续养育6周，使急性上皮性角膜炎愈合并使病毒在三叉神经节或角膜内建立潜伏感染。7周后于裂隙灯下检查角膜情况，除外角膜有病变的鼠（角膜有病变难以判断病毒处于何期并且角膜病变影响下一步实验的观察）。100只鼠中，90只鼠的角膜光滑透明，被确定为继续实验的对象。

3.单克隆抗体的制备和鼠的注射：（1） 单克隆抗体的制备：杂交瘤细胞GK1.5和H-35在含有5 %胎牛血清的DMEM中分别分泌鼠的特异性抗T淋巴细胞亚群的单克隆抗体GK1.5（抗CD^＋₄）和H-35（抗CD^＋₈）；用硫酸胺沉淀法将抗体从杂交瘤细胞培养液中提纯；分光光度计法检测GK1.5和H-35单克隆抗体，GK1.5及H-35的浓度分别为24.5 g/L和19.8 g/L。（2）动物的分组：随机将90只处于病毒潜伏期的鼠分为3组，每组30只。第1、2组为实验组，分别注射单克隆抗体GK1.5和H-35，因此称为抗-CD₄组和抗-CD₈组；第3组为对照组，注射鼠的非特异性免疫球蛋白（RatIgG，购自美国Jackson Immunoresearch公司），称为抗体的对照组。注射时间及剂量：3组均于紫外线照射角膜的前1日、当天及照射后的第2、4、7、14、21及28天，于鼠的腹腔内注射相应的抗体或免疫球蛋白各0.5 mg。另外，30只未感染过HSV-1的NIH鼠作为紫外线B光照射角膜的对照组，称为空白对照组。

4.紫外线B光照射鼠角膜病毒的激活及SK的复发：紫外线 B光光源为TW20 Chromato-Vu transilluminator（美国UVP公司产品)。其光波波长为302 nm。每只鼠的右眼接受170 mJ/cm²光的照射。于紫外线B光照射角膜的当天及照射后的第7天内，每天用蘸有DMEM的棉签擦拭右角膜1次，并将擦拭液用非洲绿猴肾细胞的细胞培养。检测鼠角膜擦拭液中单纯疱疹病毒，并判定其病毒是否被激活及SK复发。

二、流式细胞仪和T淋巴细胞亚群的排除量

于紫外线B光照射角膜后的第7天，即腹腔内第5次注射抗体时，取鼠的左眼眼眶血0.2 ml做荧光抗体染色、流式细胞仪分析，判断单克隆抗体排除T淋巴细胞亚群的有效性。选择美国PharMingen公司生产的藻红蛋白联结的大鼠抗小鼠CD⁺₄、CD^＋₈ T淋巴细胞抗体［R-phycoerythrin-conjugated rat anti-mouse CD₄（L3T4）和R-phycoerythrin-conjugated rat anti-mouse CD₈（ly-2）］作为标准荧光抗体。采用美国FACS 440型流式细胞仪检测正常鼠及注射单克隆抗体的实验鼠的外周血中CD^＋₄或CD^＋₈T淋巴细胞占细胞总数的百分比。流式细胞仪显示的荧光素-2直方图中，以荧光强度为横坐标，以细胞数为纵坐标，曲线下面的面积即为收集的细胞数量，同时，流式细胞仪以数据显示荧光标记细胞（CD^＋₄或CD^＋₈ T 淋巴细胞）占收集细胞总数的百分比。

三、临床观察

分别于紫外线B光照射角膜后的1、2、3、4及5周时，用裂隙灯显微镜检查角膜改变。（1）角膜基质混浊的判分标准：0分，角膜基质清晰透明；1分，角膜基质稍混浊；2分，角膜基质中度混浊，可透见后部虹膜特征；3分，角膜基质重度混浊，但仍可判断瞳孔缘的位置；4分，角膜基质完全混浊，失去了后部特征。（2）角膜新生血管的判分标准：0分，无新生血管长入角膜；1分，新生血管向心性生长，但未达到瞳孔中央或未超过角膜半径；2分，新生血管达到瞳孔中央或超过角膜半径。

四、迟发型超敏反应（DTH）