【摘要】目的评价共焦显微镜(confocal microscopy)在真菌性角膜炎(fungal keratitis)临床诊断中的应用价值。方法利用共焦显微镜对临床拟诊为真菌性角膜炎的43例患者进行检查，并用双盲法同时行涂片或活体检查真菌菌丝，对两组结果进行比较。结果43例患者中，31例行共焦显微镜检查可见真菌，综合各项检查结果并结合临床表现，32例确诊为真菌性角膜炎，共焦显微镜的确诊率为96.9%。结论共焦显微镜检查是一种快速、有效和无损害的活体检查手段，在真菌性角膜炎的早期诊断、治疗和研究中将起重要作用。

Clinical diagnosis of fungal keratitis by confocal microscopy

XIE Lixin, LI Shaowei, SHI Weiyun, et al.

Institute of Ophthalmology, Shandong Academy of Medical Sciences, Qingdao 266071

【Abstract】ObjectiveTo illustrate the value of confocal microscope in the diagnosis of fungal keratitis.MethodsIn vivo confocal microscopy was performed on 43 patients of suspected fungal keratitis. The results were compared to that of smears and biopsies.ResultsFungal filaments were imaged in 31 of 43 patients' corneas. Fungal keratitis was diagnosed in 32 patients based on clinical signs and all the methods of examinations. The positive rate of confocal microscopy is 96.9%.ConclusionConfocal microscopy can be a rapid, effective and noninvasive imaging technique, and it is helpful in the diagnosis, treatment and study of fungal keratitis.

【Key words】Microscopy, confocalCorneaEye infections, fungal

真菌性角膜炎是一种危害严重的致盲性疾病，其中的一个主要原因是由于缺乏有效的早期诊断方法，从而常导致误诊并延误治疗。眼科共焦显微镜的出现，使真菌性角膜炎的早期诊断成为可能。共焦显微镜是一种新型、无创伤性角膜影像学检查仪器，它可以在活体上对角膜从四维(三维空间和时间)水平进行扫描成像，并提供高清晰度和放大倍率的角膜各层面图像，使人们可以从细胞水平上对活体角膜的病理生理进行直接观察研究^［1］。目前已经有人将此技术应用于阿米巴等感染性角膜炎的临床诊断^［2］，仅见2例用于真菌性角膜炎的个案报道^［3］。为积累其应用经验，并对共焦显微镜检查用于真菌性角膜炎临床诊断的价值进行评价，我们采用日本Tomey公司生产的CONFOSCAN共焦显微镜对43例(均为单眼)临床拟诊为真菌性角膜炎的患者进行检查，现将结果报告如下。

资料和方法

1.一般资料：选择本院门诊患者43例，男35例，女8例；年龄18～72岁。病程1周至2个月。角膜溃疡面积为2 mm×2 mm至全角膜，部分患者伴有前房积脓。均为抗生素药物治疗无效或按溃疡形态特征，而被拟诊为真菌性角膜炎者。

2.先行常规的角膜分泌物涂片或取病变处角膜组织活检，加10%氢氧化钾后在生物显微镜下查找真菌菌丝和孢子。然后再行共焦显微镜检查，将两种检查的结果进行对照，如两种检查结果不一致，立即再次重复检查。

3.共焦显微镜检查方法：患眼用0.4%盐酸丁氧普鲁卡因液滴眼2次，开睑器开睑，患者的下颌及前额固定在显微镜上的检查托架上。在40倍水浸式圆锥状物镜(achroplan 40/0.75 W)表面涂等张的人工泪液(Vidisic-Gel)，将镜头轻缓前移，使表面的人工泪液与角膜病变处接触，镜头与角膜之间的距离为2 mm。将镜头缓缓前移，角膜各层的扫描图像即可通过电脑显示器快速显示，图像同时被S-VHS录像机记录，检查结束后慢放录像，仔细分镜头重复检查，选定清晰图像存入计算机，微机软件可对1 μm的结构进行测量和分析，然后由打印机打出结果。图像也可由Sony Up-860 Video graphic printer直接打出，或用幻灯制作系统拍照以供发表。

结果

综合各项检查结果和临床表现，43例患者中32例确诊为真菌性角膜炎。首次常规溃疡面涂片和活体检查，43例中20例查到了不同形态的菌丝。共焦显微镜检查到的31例阳性患者，其中包括上述20例中的19例；1例活检阳性者，共焦显微镜仔细复查仍未查到菌丝。而共焦显微镜检查阳性，涂片或活检阴性的12例中，经反复涂片和活检又有8例查到了菌丝。

共焦显微镜显示的菌丝图像是在相对暗的背景中的明亮的线状形态(图1)，在一些病例中也可见到孢子，其形态和菌丝分支的角度同活检标本的镜下观相似，多数的菌丝直径＜6 μm，孢子直径约10～20 μm(图2)。

图1角膜溃疡处明亮的丝状线条（箭头），直径约3～6 μm共焦显微镜×40/0.75

图2 角膜溃疡内可见大量菌丝(长箭头)和孢子(短箭头)，

菌丝直径约6～10 μm共焦显微镜×40/0.75

讨论

1.共焦显微镜诊断真菌性角膜炎的优点：目前，真菌性角膜炎的临床诊断方法有多种，常见的有涂片法、组织活检法和体外培养法，也有人用活体的免疫荧光法。但是，这些方法均存在缺陷。涂片和活检的方法，在取不到菌丝时可造成假阴性，往往需要反复多次检查才能得到阳性结果，不但费时，而且会对角膜增加创伤使炎症扩散。此外，操作者的手法和医师的临床经验对结果的可靠性影响也较大。本研究首次涂片和活检的阳性率仅为62.5%(20/32)，经反复检查后才达到87.5%(28/32)。体外培养的方法同样也受到取样的影响，一般需要2周以上才能有阳性结果，要确定阴性结果至少需3周以上。因此不利于临床治疗。目前应用较少的免疫荧光法，也存在试剂的敏感性问题。

共焦显微镜却具有其它方法不能比拟的优点：(1)对角膜无损伤，检查时镜头并未与角膜直接接触，而是通过一种对角膜有保护作用的等张人工泪液进行检查。(2)可在数十秒至几分钟内对角膜进行全面的检查。由于它可以每秒24次扫描的速度对角膜进行连续的断层成像，因此，几乎角膜上任何细小的变化均可以捕捉到。(3)真菌检查的阳性率高。本组共焦显微镜对真菌检查的阳性率为96.9%(31/32)。而在本组全部32例阳性患者中，尽管进行了反复的涂片和活检，仍有4例未能查到真菌，而共焦显微镜却查到了清晰的菌丝。4例中，2例溃疡直径为＜2 mm，1例已经在外院应用抗真菌药物并反复进行溃疡刮片，1例为角膜层间脓肿，角膜表面已经难以刮到菌丝。因此，共焦显微镜既可以对真菌性角膜炎进行早期诊断，同时也可以观察疗效并指导治疗。

2.共焦显微镜诊断真菌性角膜炎的注意事项：因为真菌性角膜炎主要是由曲霉菌、镰刀菌等丝状菌和能产生假菌丝的念珠菌所引起，故我们对真菌性角膜炎的诊断主要是以检测到菌丝为依据。但也同样观察到了真菌胞子，它们的直径一般＞10 μm，而且具有区别于角膜基质细胞的特殊形态，这些真菌的形态与生物显微镜下所见相似，故只要有相应的专业知识也不难识别。但是，目前对各种真菌的共焦显微镜的图像特点不详，进行精确的菌种鉴别尚有困难。如果根据培养的结果进行菌种鉴定，再对照各个菌种的共焦显微镜图像，可能会对一些真菌菌种的成像特点有所认识，甚至达到通过共焦显微镜对真菌进行初步分型诊断。另外，检查者应当对角膜基质神经干和上皮下神经分支有所认识，以免误诊为菌丝。基质神经干的直径一般为20 μm以上，而上皮下的神经分支多而杂乱。在行共焦显微镜检查时，应注意以下事项：(1)检查前应充分进行表面麻醉，这样可以防止由于刺激引起患者流泪，稀释粘稠剂而影响图像的采集。(2)线状开睑器的应用是十分必要的，尤其是对一些眼部刺激较重的患者，可以防止睫毛和眼睑对粘稠剂的影响，并可充分暴露角膜。(3)在病变区域的图像有很强的反光，不容易辨别菌丝，应适当降低光的亮度。这样形成的图像是背景较暗的、被破坏的、无结构的角膜组织，而菌丝则呈较亮的线状，对比非常鲜明。再者，降低光的强度也可以减轻强光对患者的刺激。另外，病变边缘的图像较清晰，可见较典型的角膜基质细胞，以及侵入其间的菌丝。(4)当感染波及角膜全层时，共焦显微镜对深层的菌丝和组织难以检查出清晰的图像，只能对浅层菌丝进行检测。这是因为太厚的病变角膜坏死组织与菌丝的折光强度相似，另外，本研究的共焦显微镜用的是普通灯光源，其穿透能力有限，尤其当角膜混浊严重时，其光线的穿透力和反射回来的光线均会显著下降，这将明显影响成像质量。据报道，一些激光光源的共焦显微镜成像效果较好，但对患者可能有潜在的危害^［1］。(5)一些菌丝的图像对比度欠佳，可能与不同菌种的光线曲折力不同有关^［3］。本组患者中唯一的1例共焦显微镜未能查出的菌丝，可能与此有关，因为该患者的菌丝在生物显微镜下的对比度也很低，比较难以辨认。因此，究竟有哪些菌种比较难以检查，目前尚缺乏这方面的经验。

由于共焦显微镜是一种新的检查仪器，人<