关键词： 玻璃体视网膜病，增生性；色素上皮，眼；细胞死亡；神经生长因子/分析受体，神经生长因子/分析；肿瘤坏死因子/分析

【摘要】目的检测增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)玻璃体切割液标本内是否存在细胞凋亡，观察Fas抗原(Fas)和Fas配体(Fas ligand，FasL)与细胞凋亡的关系。方法11例PVR新鲜玻璃体切割液标本细胞离心涂片，末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine 5-triphosphate nick-end labelling，TUNEL)染色检测凋亡细胞，以及Fas、FasL和细胞类型特异抗原细胞角蛋白(cytokeratin,CK)免疫组织化学检测，并与2例角膜移植后的供体眼正常对照标本的上述检查结果相对比。结果正常人视网膜Fas和FasL弱表达。Fas、FasL、CK和凋亡见于所有PVR玻璃体切割液标本。TUNEL阳性细胞占总细胞数的20.53%。70.35%、51.58%和82.97%的细胞分别高表达Fas、FasL和CK。Fas和凋亡的直线相关系数为0.99(P＜0.001)。结论PVR眼玻璃体切割液标本可见Fas、FasL的表达和细胞凋亡。Fas和FasL的高表达可能与PVR中增生的视网膜色素上皮细胞凋亡有关。

中国图书资料分类法分类号R774.1R446.62

Apoptotic cells in vitrectomy specimens of proliferative vitreoretinoathy

LIU Bing,HUI Yannian,HUANG wei.Department of Ophthalmology,Xijing Hospital,The Fourth Military Medical university,Xian710032,China

【Abstract】ObjectiveTo observe whether apoptosis was involved in cells of aspiration fluid from vitrectomy for proliferative vitreoretinopathy(PVR),and whether there was an association with expression of Fas antigen(Fas)and Fas ligand (FasL).MethodsCytocentrifuge slides of 11 fresh vitreous specimens of PVR were prepared to be stained by tUNEL method for detection of apoptosis and by immunohistochemical technique for detection of Fas,FasL，and cytokeratin (CK),a cell-type specific antigen.ResultsFas and FasL were expressed in normal human retina.Fas,FasL,CK，and apoptosis were found in all preparations.TUNEL-positive cells were 20.53% in total cells.70.35%,51.58%，and 82.97% of cells highly expressed Fas,FasL，and CKrespectively.The linear correlation coefficient of Fas and apoptosis was 0.99(P＜0．001).ConclusionVitrectomy specimens of PVR showed expression of Fas，FasL，and apoptosis.Prominent Fas and FasL expressions may be associated with apoptosis of proliferating retinal pigment epithelial cells in the vitreous of PVR.

【Key Words】Vitreoretinopathy,proliferativePigment epithelium of eyeCell deathNerve growth factors/analysisReceptors,nerve growth factor／analysisTumor necrosis factor/analysis

增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的实质是眼内细胞过度增生^［1］。细胞增生与死亡失衡可能是引起PVR的原因。诱导增生细胞凋亡，可能为临床防治PVR开辟一条新路。Fas抗原及其配体作为细胞凋亡的一个重要系统已有较多研究^［2-4］。我们通过对PVR玻璃体切割液中细胞Fas抗原及Fas配体免疫组织化学染色及凋亡细胞的TUNEL检测，观察Fas抗原及其配体系统与PVR眼玻璃体内的细胞凋亡的关系。

1材料与方法

1.1玻璃体切割液的收集11例PVR(C级5例，D级6例)，均使用Storz公司premiere玻璃体切割机，切速600～750次/min，吸力300mmHg（1mmHg＝0．133kPa），切割灌注液为眼用平衡盐液。术毕收集玻璃体切割液，用高速冷冻离心机4℃、3 000 r/min，离心10分钟，弃上清；800r/min，再离心5分钟，细胞离心涂片，－20℃保存备用。Fas阳性标本取自一慢性乙肝及肝硬化患者的肝组织。FasL阳性标本取自小鼠胸腺。2例正常对照标本取自角膜移植后的供体眼球。上述标本经10%福尔马林固定，常规酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，5μm切片，－20℃保存备用。

1.2试剂与主要仪器兔抗人Fas及抗人和鼠的Fas配体多抗(美国Santa cruz公司)，鼠抗人细胞角蛋白(CK)单抗(中国中山公司)，TUNEL试剂盒(美国Oncor公司)，SP^TM试剂盒(美国ZYMED公司)，Olympus显微镜(日本)，细胞离心涂片机(Cytospin3，英国Shandon)，全自动高速冷冻离心机GL20A(湘西仪器仪表总厂科学仪器厂)。

1.3免疫组织化学染色采用过氧化酶标记的链霉卵白素染色系统。将低温保存的标本在0.01mol/L磷酸盐平衡液(phosphate-buffered saline，PBS)(pH7.4)中浸泡5分钟。0.3%曲安通溶液室温孵育15分钟，漂洗。3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育10分钟，漂洗。10%正常羊血清湿房内37℃封闭30分钟，分别加入第一抗体(Fas1∶50，FasL1∶50，CK1∶100)，湿房内4℃过液，漂洗；第二抗体(1∶00)湿房，37℃，30分钟，漂洗；辣根酶标记链霉卵白素(1∶100)湿房，37℃，30分钟，漂洗；3，3-二氨基联苯胺-4盐酸(3，3-diaminobenzidine-4HCl，DAB)显色，自来水冲洗，苏木素复染，常规酒精脱水，透明，封片，显微镜下阅片，照相。

石蜡标本常规脱蜡至水，余步骤同上。11例细胞离心涂片标本均有不加第一抗体染色的阴性对照。

1.4TUNEL染色^［5］细胞涂片入水，蛋白酶K20μg/ml，消化15分钟。3%H₂O₂-PBS溶液5分钟，50μl平衡液I(buffer1，TUNEL试剂盒)1分钟。含末端脱氧核苷转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT)6μl的反应液20μl，37℃，湿盒孵育1.5小时。预热的中止反应液，37℃，30分钟，中止反应，buffer1漂洗15分钟，2次；加2%正常羊血清37 ℃，湿盒孵育20分钟，抗地高辛碱性磷酸酶抗体，37℃温盒孵育2小时；buffer 1，平衡液Ⅲ(buffer 3，TUNEL试剂盒)中分别振荡漂洗，新鲜配制显色液，暗处过夜显色；中止显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片。

1.5阳性细胞计数抗Fas、FasL、CK阳性染色均位于细胞浆内，为棕黄色，细丝状，分布不均匀，细胞核淡染，呈浅灰蓝色。凋亡细胞阳性信号为覆盖整个细胞核的深蓝色着色。每例选择20个高倍镜视野，用网格测试法按公式计算阳性细胞百分率：阳性细胞百分率=Σ阳性细胞数/Σ高倍镜视野内细胞数×100%。

1.6统计学分析直线相关分析，t检验。

2结果

Fas抗原在正常全厚视网膜内均有表达，在神经纤维层较强。三种神经元细胞亦有表达，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达较弱(图1)。FasL在RPE细胞、视杆和视锥细胞呈弱阳性。外丛状层表达明显，向内颗粒层逐渐减弱。在视网膜神经纤维层可见梭形细胞表达FasL(图2)。TUNEL检测在全层视网膜未见凋亡细胞。

PVR C级5例，PVR D级6例，对玻璃体切割液细胞离心涂片的免疫组织化学染色均有Fas抗原强阳性表达的细胞(图3)。阳性细胞占所有细胞的比例为：(70.35±27.60)%(27.40%～96.52%)，PVRC级和D级间阳性细胞百分率无差别(P＞0.05)。11例的细胞标本均见FasL强阳性表达的细胞(图4)，阳性细胞百分率为(51.58±26.47)%(17.65%～83.80%)。凋亡细胞(图5)所占的比例为(20.53±12.58)%(2.00%～36.36%)。Fas表达的细胞阳性率与凋亡细胞率的直线相关系数r值为0.99(P＜0.001)；FasL与凋亡细胞的r值为0.64(0.001＜P＜0.005)；Fas与FasL的r值为0.77(P＜0.05)。CK阳性细胞率为：(82.97±4.76)%(76.00%～90.00%)(表1)。

图1正常人眼视网膜Fas表达。视网膜呈Fas阳性，RPE细胞(箭)反应较弱SP×100图2正常人眼视网膜FasL表达。RPE细胞(箭)弱表达，神经纤维层可见一梭形阳性细胞(箭头)SP×100图3PVRD₁级玻璃体切割液细胞离心涂片Fas表达。Fas阳性细胞(箭)含色素颗粒，阴性细胞(箭头)SP×132图4PVRC₂级玻璃体切割液细胞离心涂片FasL表达。FasL阴性细胞(箭头)呈成纤维细胞样，阳性细胞(箭)SP×132图5PVRD₂级玻璃体切割液细胞离心涂片凋亡细胞。凋亡细胞含深蓝色细胞核(箭)，阴性细胞(箭头)TUNEL×132Fig.1Fas antigen expression in a normal control retina．Fas-positive retinal and weaker immunoreactivity in RPE cell(arrow)SP×100Fig.2FasL expres-

sion in a normal control retina.RPE cell(arrow)is als