关键词： 视网膜变性；基因扩增；序列分析；动物，实验；聚合酶链反应

【摘要】目的克隆大鼠视网膜缓慢变性／盘膜边缘蛋白(retinal degeneration slow／peripherin，RDS/peripherin)基因。方法以SD大鼠的视网膜polyA⁺RNA为模版，采用RT-PCR的方法扩增一段约1555bp的cDNA片段，并亚克隆至pBluescriptⅡKS(+)载体中，进行限制性内切酶酶切和序列分析。结果证实所克隆的片段是大鼠的RDS/peripherincDNA，与Begy等报道的序列^［1］相比，除3′端非翻译区的第1242位的碱基A→G，第1409～1411位碱基CA→CCA外，其它序列基本一致^［1］。结论已获得大鼠RDS/peripherin基因的cDNA，为研究RDS/peripherin基因的功能及在视网膜变性疾病中的作用奠定实验基础。

中国图书资料分类法分类号R774．13R730．43R392．11

Cloning of rat RDS/peripheringene

GAO Ling,YAN Mi,CHEN Danian,et al.Department of Ophthalmology,The First ClinicalMedical College,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041,China

【Abstract】ObjectiveMolecular cloning of rat retinal degeneration slow(RDS)gene cDNA.MethodsUsing PolyA⁺RNA from retina of SD rat as template,a 1555bp positive cDNA band was obtained by RT-PCR and subcloned into pBluescriptⅡKS(+)vector.The cloned fragment was analyzed with restriction endonucleases and sequencing.ResultsIt had been proved that the cloned fragment was rat RDS/peripherin cDNA.Except for the substitute of A1242G and CA1409-1411CCA,the other sequences corresponded to thatreported by Begy.ConclusionRat RDS／peripherin cDNA was obtained.Researches on function of rat RDS／peripheringene and its role in retinal degeneration are under way.

【Key words】Retinal degenerationPolymerase chain reactionAnimals,laboratoryGene amplificationSequence analysis

盘膜边缘蛋白(peripherin)在促进光感受器细胞外节盘膜的形成和稳定方面起着重要作用^［2］。编码盘膜边缘蛋白的RDS基因突变可导致多种视网膜变性疾病，但致病机制尚不清楚^［3］。为了进一步研究该基因的功能和可能的致病机制，我们用RT-PCR的方法克隆大鼠的RDS/peripherin基因，使之能用于RDS/peripherin基因的表达和功能研究。

1材料和方法

1.1酶及特殊试剂Superscript^TM预扩增cDNA第一链合成系统(Gibcobrl公司)、Expand^TM High fidelity PCR system、EcoRⅠ、SalⅠ、PstⅠ、ScaⅠ(Boehringer公司)；大鼠视网膜polyA⁺RNA(Clontech公司)；λDNA/HindⅢ和PCR分子量标准、大肠杆菌JM109、T₄DNA连接酶(华美生物制品公司)；Wizard DNA clean-upkit、Wizard Plus Miniprep Pu-rification kit(Promega公司)；载体pBluescriptⅡKS(+)(华西医科大学遗传室)。

1.2PCR引物设计及合成参照Begy等^［1］报道的大鼠RDS/peripherincDNA的全序列，设计并合成了5′端引物和3′端引物。其中5′端引物长度为26bp，引入了一个EcoRⅠ识别位点。3′端引物长度为33bp，引入了一个SalⅠ识别位点。5′端引物：TTTG↓EcoRIAATTCACTCCCTGCAGCTTGGGC；3′端引物：TTTG↓SalⅠTCGACCTTGATTTTATGTGTCAAAT-AATG，由GIBCO公司合成。

1.3逆转录PCR扩增目的片段按GIBCO公司提供的试剂盒使用说明书进行cDNA第一链合成：反应体系20μl，其中含Oligo(dT)lμl、大鼠视网膜polyA⁺RNA100μg。反应条件：42℃水浴50min，70℃水浴15min终止反应。

PCR扩增：总体积50μl，其中逆转录产物4μl、上下游引物各2μl(40pmol)、High fidelity PCR system4.2U，置PTC200热循环仪中进行标准PCR反应。循环参数设定为：94℃1min、52℃1min、72℃1min。28个循环后72℃延伸7min。取8μlPCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。

1.4目的片段的克隆及测序^［4］PCR产物经EcoRⅠ、SalⅠ酶切，采用Wizard DNA clean-up kit和低熔点琼脂糖回收目的片段，与pBluescriptⅡKS(+)载体的EcoRⅠ、SalⅠ酶切片段连接，转化JM109感受态细胞，筛选重组质粒。重组质粒经Wizard Plus Miniprep Purification kit纯化后，利用pBluescript Ⅱ KS(+)的通用引物(T₇和T₃promotor primer)，采用Sanger双脱氧链终止法对克隆的cDNA序列进行分析(赛百盛公司)。

2结果

2.1PCR扩增的结果和鉴定取8μlPCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳，以PCR分子量标准为参照(图1)，大约于1.5kb处有一条DNA条带，与预期的长度(1555bp)相符。

2.2克隆结果筛选的克隆经EcoRⅠ+SalⅠ双酶切证实：扩增片段已插入到pBluescriptⅡKS(+)载体中(图2)。EcoRⅠ+PstⅠ、EcoRⅠ+ScaⅠ酶切后分别产生1.1kb+3.4kb、500bp+1.1kb+2.9kb，与预期的长度相符(图3)，提示我们克隆的DNA片段是大鼠的RDS/peripherincDNA。

2.3测序结果序列分析结果表明克隆基因长度为1555bp。与Begy等报道的序列相对比^［1］，证实克隆的基因包含了大鼠RDS/peripherincDNA的5′端非翻译区和编码区的全部序列、3′端非翻译序列。根据序列分析结果，整理出克隆的SD大鼠RDS/peripherincDNA的序列(图4)。

图1RT-PCR扩增产物的电泳检测：PCRmarker(M)、1：扩增的PCR产物图2目的片段的酶切分析。M1：λDNA/HindⅢ分子量标记、1-5：EcoRⅠ+SalⅠ双酶切、M2：PCR分子量标准图3重组质粒pBluescript-RDS限制性内切酶酶切分析：M1：λ DNA/Hind Ⅲ 分子量标记、1：EcoRⅠ+ScaⅠ双酶切、2：EcoRⅠ+PstⅠ双酶切、3：EcoRⅠ+SalⅠ双酶切、M2：PCR分子量标记Fig.1RT-PCR products of RDS cDNA.M1:PCR markers、lane 1:the PCR produtsFig.2Identification of amplified segment.M1:λDNA/Hind Ⅲ marker、lanel-5:EcorⅠ+SalⅠ digested、M2:PCR markersFig.3Restriction analysis of recombinant plasmid pBluescript-RDS.M1:λ DNA/Hind Ⅲ markers、lane 1:EcoRⅠ+ScaⅠ digested pBluescript-RDS plasmid、lane 2:EcoRⅠ+Pst I digested pBluescript-RDS plasmid、lane 3:EcoRⅠ+Sal Ⅰ digested pBluescript-RDS plasmid、m2:PCR markers

3讨论

RDS小鼠视网膜的光感受器细胞外节发育异常，然后光感受器细胞缓慢变性死亡，其病理改变过程与人视网膜色素变性极其相似^［5］。Travis采用消减杂交法从6～7周的C57BL/6小鼠minus6～7周的rd/rd小鼠视网膜文库中首次分离了正常小鼠的野生型RDS/peripherin基因的全长度cDNA克隆，并且发现RDS/RDS小鼠存在RDS/peripherin基因缺陷。基因第2外显子(cDNA序列中第899位核苷酸)插入了约10kb的外源性基因片段，导致编码的蛋白产物C端的87个氨基酸残基被截断^［6］。把正常拷贝数的RDS/peripherin基因插入到RDS小鼠后，观察到正常光感受器细胞外节的形成，在形态学上未发现光感受器细胞变性的征象^［7］。动物实验结果提示：RDS/peripherin是视网膜变性的候选基因。

在视网膜色素变性^［8］、黄斑营养不良^［9］等患者中相继发现了RDS/peripherin基因突变。连锁分析同样提示：RDS/peripherin基因可能是视网膜变性疾病的候选基因。但目前对RDS/peripherin基因的正常功能和突变基因的致病机制知之甚少。为了进一步探讨RDS/peripherin基因在体外、体内对光感受器细胞的作用，本研究克隆了大鼠RDS/peripherin基因，为研究视网膜变性的致病机制和治疗奠定了物质基础。

图4克隆的SD大鼠RDS/peripherin基因的cDNA序列(下划线：阅读框架)及与文献报道的序列(斜体)的比较^［1］。

Fig.4Sequences of colned RDS/peripherin cDNA of SD rat(underlined:reading frame)as compared with that reported in literature(italics)^［1］.

根据小鼠、人、牛、大鼠的cDNA序列，预测相应RDS/peripherin蛋白的氨基酸序列，发现同源性为85%，其中大鼠和小鼠同源性为97.1%^［10］。根据这一特点，我们参照从GeneBank中查询到的大鼠RDS/peripherin全长度的cDNA序列，设计并合成了引物，以SD大鼠的polyA⁺RNA为模版，采用RT-PCR的方法成功