摘要 目的研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）对体外培养的牛眼晶状体上皮细胞中原癌基因fos ，jun，myb，myc，ras等蛋白产物表达的作用。方法细胞经10U／ml TNF-α作用不同时间后，采用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）免疫酶标技术测定蛋白表达。结果经TNF-α作用后，几种原癌基因表达的阳性细胞百分率均明显增高（P＜0.01）。fos ，jun，myb，ras在刺激1h后即达到顶峰，myc在刺激2h后达到顶峰，随后很快下降，恢复至正常水平。同时，细胞的阳性反应强度增加，细胞核内变化更为明显。结论TNF-α通过激活细胞内原癌基因的表达而促进晶状体上皮细胞的增殖。

分类号R776

Effects of tumor necrosis factor α on the expression of proto-oncogenes in lens epithelial cells

Zhang XiaohongLi XiaorongSun Huiminet al．

（International Intraocular Implant Training Centre，Tianjin Medical University，Tianjin 300070）

AbstractObjective To assess the effects of tumor necrosis factor α（TNF－α）on the expression of proto-oncogenes（fos，jun，myb，myc，ras）in bovine lens epithelial cells（LECs）in vitro．MethodsThe third passage LECs were used for the experiments．5×10⁴／ml cells were seeded in the presence of 10U／ml TNF-α using 24-well tissue culture plate．After 1，2，4，8h，the protein expression was assessed by avidin-biotin-peroxidase complex immunostaining method．ResultsThe incubation with TNF-α increased the percentage of positive cells and the intensity of staining significantly（P＜0.01）．The expression of fos，jun，myb，ras proteins reached the highest level after incubation for 1h，so did myc protein after 2h-incubation．Jun and ras expression lasted shortly，returning to control level within 4h，while that of fos and myb returned to control level until 8h．All these changes were more apparent in nucleus．ConclusionTNF-α could stimulate proto-oncogene expression，prior to its effect on cell proliferation．TNF-α could stimulate expression of proto-oncogenes to regulate cell cycle．It may play an important role in posterior capsule opacification through promoting LECs proliferation．

Key wordslens epithelial cells tumor necrosis factor proto-oncogene

晶状体后囊混浊是人工晶状体植入术后的主要并发症，病因尚不十分清楚。体内多种细胞因子对晶状体上皮细胞的作用已越来越受到重视。我们发现肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）对体外培养的牛、人晶状体上皮细胞具有明显的促增殖作用^［1］。为进一步了解其作用机制，我们研究TNF-α对体外培养的牛眼晶状体上皮细胞中几种原癌基因蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM培养液为美国Sigma公司产品；胎牛血清（fetal calf serum，FCS）购自中国医学科学院血液学研究所；重组人TNF-α（10U／ng）、抗人myc蛋白抗体、抗人ras蛋白抗体购自北京邦定生物医学公司；抗人fos蛋白、jun蛋白、myb蛋白抗体以及免疫酶标试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

1．2 细胞培养

取新鲜牛眼，剪去眼球周围组织及结膜，75％乙醇浸泡两次，各10min。于超净台中沿角膜缘剪开，划断悬韧带，取出晶状体。撕下前囊，经D-Hanks液冲洗后，剪碎，置于DMEM培养液（pH7.2～7.4，含10％FCS）中。37℃，5％CO₂，饱和湿度培养。每3天换液1次。

1．3 TNF-α对牛眼晶状体上皮细胞的作用

实验选用第3代细胞。将细胞数调整至5×10⁴／ml，接种于24孔培养板（每孔内预置5mm²玻片）内，加入10U／mlTNF-α。培养1，2，4，8h后，取出每孔内玻片，经D-Hanks液冲洗后，室温下晾干，-20℃冰箱保存，备用。

1．4 原癌基因蛋白产物的测定

采用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（avidin-biotin-peroxidase comple，ABC）免疫酶标法^［2］。一抗为待检抗原相应的抗体，二抗为生物素标记的IgG抗体，三抗为卵白素-辣根过氧化物酶复合物。结果的判定采用阳性细胞百分率法和常规细胞化学强度积分法：前者，每张片子连续计数500个细胞，计算出阳性细胞所占比例；后者，即以－，＋，＋ ＋，＋ ＋ ＋，＋ ＋ ＋ ＋5个等级表示反应强度，分别以0～4分计，乘以每级强度的阳性细胞百分率，其总和作为积分值。

1．5 统计学处理采用配伍设计的秩和检验^［3］。

2 结果

由图la可见，正常对照组细胞中fos，jun，myb，myc，ras等原癌基因蛋白产物均有不同程度的表达。经TNF-α作用后，阳性细胞百分率明显提高（P＜0.01）。其中fos，jun，myb，ras蛋白表达均在TNF-α作用1h后达到顶峰，jun和ras持续时间较短，4h即降至接近对照水平；fos和myb到8h恢复正常。myc蛋白在TNF-α作用2h后才升至最高水平，而后缓慢下降。

由阳性积分面积计算也得到相似的变化趋势（图1b）。经TNF-α作用后，细胞内阳性反应面积增大，颜色加深，由黄色而呈棕色，细胞核内的阳性反应变化更加明显（图2，3）。

图1 TNF-α对晶状体上皮细胞中原癌基因表达的作用

Fig．1 Proto-oncogene expression in bovine LECs cultured with TNF-α

3 讨论

由于白内障手术破坏了血-房水屏障，术后早期炎症反应引入大量炎性细胞、炎性因子，改变了房水成分。有报道巨噬细胞调理液可促进晶状体上皮细胞增殖^［4］，而巨噬细胞被激活后早期主要合成分泌TNF-α。我们利用重组人TNF-α发现，1U／mlTNF-α即可明显促进体外培养的牛、人晶状体上皮细胞增殖，且可持续至72h^［1］。为了解TNF-α的分子机制，我们采用ABC免疫酶标法研究TNF-α作用后几种原癌基因蛋白的表达情况。

癌基因指逆转录病毒核酸中可以引起细胞发生转化的一段核苷酸序列，正常细胞中与病毒癌基因序列同源的基因称原癌基因，可大致分为生长因子型、信号转导型、核蛋白型等几大类^［5］。本文结果表明，TNF-α作用后，晶状体上皮细胞中fos，jun，myb，myc，ras等原癌基因表达的阳性细胞百分率明显升高（P＜0.01），但各种蛋白的升高时相不同。TNF-α作用1h后，fos，jun，myb，ras等蛋白的表达即达到高峰，以后逐渐下降，jun和ras在4h基本恢复正常，fos和myb到8h恢复正常。myc基因则启动较慢，TNF-α作用2h后其蛋白水平升至最高峰。

ras蛋白相对分子质量为21×10³，具有GTP酶活性，在转导生长因子受体激发的信号上起作用。在多种肿瘤中检测到ras基因的各种突变型，这些突变的ras蛋白可使细胞不再依赖生长因子而持续增殖。c-fos，c-jun，c-myb，c-myc基因均编码核蛋白，参与细胞周期的调控。fos，jun蛋白具有亮氨酸拉链结构，二者可形成异二聚体，与DNA序列中AP-1位点结合，启动基因转录。jun蛋白自身也可形成二聚体，但转录活性较弱。myb与fos蛋白一样为核内磷酸蛋白，与DNA结合后调节转录。已经发现在一些恶性肿瘤中有myb基因的重排和过度表达。c-myc基因是当逆转录病毒启动子／增强子插入而产生肿瘤性活化时被发现的第一个癌基因，属细胞周期早期基因，受到刺激后比c-fos，c-jun等晚一些达到顶峰。

图2 TNF-α作用不同时间细胞内fos蛋白的表达。（a）对照（b）1h（c）8h（ABC法，×120）

Fig．2 Immunohistochemical staining of fos protein product in LECs（magnification×120）．（a）control；（b）1h with TNF-α；（c）8h with TNF-α．The cell nucleus was stained blue，positive reaction produced a yellow or brown color．Compared with（a），there were more positive cells in（b）．The stained area enlarged，and the reaction color also deepened．More changes located in nucleus．

图3 TNF-α作用不同时间细胞内jun蛋白的表达。（a）对照（b）1h（c）4h（ABC法，×120）

Fig．3 Immunohistochemical staining of jun protein product in LECs（magnification×120）．（a）contr