摘要目的了解活体内不同途径应用脂质体转染外源基因在眼组织的分布情况。方法将包有β-半乳糖苷酶基因质粒的脂质体DOSPER，分别采用玻璃体腔内注射、尾静脉注射、表面点药及球后注射到小鼠体内，2h，1，2天、1，2，4周后用β-gal染色法观察β-半乳糖苷酶基因在眼组织内的分布情况。结果玻璃体腔内注射、尾静脉注射、表面点药及球后注射4组的小鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜，均有β-半乳糖苷酶基因表达，除表面点药组外，其他3组小鼠脉络膜也有β-半乳糖苷酶基因表达。用药1天后开始出现β-半乳糖苷酶基因阳性表达，持续达1个月以上。结论脂质体能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜。

分类号R394．3

Experimental observation of gene transfer with liposome to murine ocular tissues by different routes of administration

Yang Hua，Zhang Xi，Guan Hongbing

（Department of Ophthalmology，Shanghai First People’s Hospital，Shanghai Eye Research Institute，Shanghai 200080）

AbstractObjectiveTo compare different routes of administration on the ability of liposomes carrying an exogenous gene to introduce that gene into murine ocular tissues．MethodsPlasmid DNA（pGME-7Zf（＋）） with beta-galactosidase gene （DOSPER） was applied topically to eyes or injected into vitreous，tail vein，or retro-orbital region of adult mice．Control and treated mice eyes were enucleated at 2h，1d and 2d，1 week，2and 4weeks post-injection or topical application．Gene expression was detected by enzymatic color reaction using beta-gal stain as a substrate in frozen sections of enucleated eyes．ResultsCell positive for beta-galactosidase expression showed blue staining of enzymatic color reaction in tissue sections．Liposome-mediated gene transfer was detected in murine cornea，iris，ciliary body and retinal ganglion cells，photoreceptors，and retinal pigment epithelium using all four routes of administration Injection into vitreous，tail vein and retro-orbital region allowed transfer of the gene into the choroid．The gene could not be transferred into murine choroid by topical application．Gene expression in murine ocular tissues was observed after 1d following injection or topical application．The expression lasted at least 1month．Blue staining indicating an enzymatic color reaction was not observed in all of control eyes．ConclusionEfficient and stable transfer of functional genes could be achieved by liposome delivery into the cornea，iris，ciliary body，choroid and retina of mice．

Key wordsocular transfer liposome

目前已发现许多致盲性遗传眼病存在不同基因突变，尤其是已查明的视网膜变性疾病的基因突变多种多样^［1］，基因转移技术是体细胞水平更正基因突变的有效方法^［2］。研究表明以病毒作为载体，可有效地转移正常的功能基因到活体眼组织，通常使用的病毒有逆转录病毒、腺病毒及单纯疱疹病毒等^［3，4］。但是在眼部应用上述病毒，有可能导致其他的病毒疾病，也就是说安全性不可靠。脂质体是一类非病毒制剂，作为基因转移的载体具有低毒性、相对价廉和使用方便等优点，而且具有一定的转染效率。本研究以脂质体作为载体，通过玻璃体腔内注射、尾静脉注射、表面点药及球后注射等多种途径给药，观察不同时期小鼠眼组织外源基因转染情况，为应用脂质体进行体细胞基因治疗奠定基础。

1材料和方法

1．1材料脂质体1，3-Di-Oleoyloxy-2-（6-Carboxy-spermyl）-propylamid（DOSPER）和β-gal染色试剂盒为德国BOEHRINGERMANNHEIM公司产品；携带β-半乳糖苷酶报导基因的重组质粒pGME-7Zf（＋）为华美公司产品。体重40g左右的昆明小鼠。美国BectonDickinson公司的30G1／2号针头，德国Leica显微镜。

1．2方法戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉小鼠，小鼠分为5组：1组：玻璃体腔内注射DOSPER与pGME-7Zf（＋）质粒的混合液；2组：尾静脉注射DOSPER与pGME-7Zf（＋）质粒的混合液；3组：眼球表面滴用DOSPER与pGME-7Zf（＋）质粒的混合液；4组：眼球后注射DOSPER和pGME-7Zf（＋）质粒的混合液；5组为对照组，上述4种途径分别使用DOSPER或pGME-7Zf（＋）或生理盐水或空白对照。

图1对照组的角膜(A)、虹膜(A，F)、睫状体(A)和视网膜(A，D)。玻璃体腔内注射DOSPER与pGME-7Zf（＋）质粒混合液后1周基因转移情况：角膜上皮细胞和内皮细胞(B)、睫状体(C)、虹膜(G)、视网膜节细胞层、光感受器层及色素上皮细胞(E)均可见β-半乳糖苷酶基因的阳性表达图2尾静脉注射DOSPER与pGME-7Zf（＋）质粒混合液后1周视网膜基因转移情况：脉络膜(a)、视网膜色素上皮细胞(b)、光感受器(c)及节细胞(d)均可见β-半乳糖苷酶基因的阳性表达Fig．1

Cornea（A），iris（A，F），ciliarybody（A）andretina（A，D）inthenormalcontrolgroup．Genetransfer1weekaftertheinjectionofDOSPERandpGME-7Zf（＋）intothevitreous．Beta-galactosidaseexpressionis

seeninthecornealepithelialcellsandendothelialcells（B），ciliarybody（C），iris（G），retinalganglioncells，photoreceptorsandpigmentepithelialcells（E）Fig．2Genetransfer1weekaftertheinjectionofDOSPERandpGME-7Zf（＋）intothetail’svein．Beta-galactosidaseexpressionisseeninthechoroid（a），retinalpigmentepithelialcells（b），photoreceptors（c）andretinalganglioncells（d）

用药后2h，1，2天、1，2，4周分别摘取上述5组小鼠眼球，立即冰冻切片，固定，PBS冲洗，β-gal染色，PBS冲洗，HE染色，甘油或中性树胶封片。显微镜下观察并照相。

2结果

结果判断：在显微镜下观察组织切片，将β-半乳糖苷酶基因表达分为3级：阴性(－)即无兰色酶反应，阳性(＋)即有兰色点状反应，强阳性(＋＋)即弥漫性兰色反应。

用药后2h，1组即玻璃体腔内注射DOSPER与pGME-7Zf（＋）质粒混合液的小鼠玻璃体腔内呈均匀一致的兰色反应(＋＋)，1组的眼球壁和其他4组小鼠眼球内均无β-半乳糖苷酶基因阳性表达(－)。

用药后1天，1组：角膜、虹膜、睫状体、视网膜节细胞层、内外核层及色素上皮层、脉络膜组织及玻璃体腔内均可见β-半乳糖苷酶基因阳性表达(＋～＋＋)。2组：角膜上皮细胞、内皮细胞、虹膜、睫状体、脉络膜及视网膜节细胞、光感受器均有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)。3组：角膜上皮细胞胞浆及胞核广泛呈兰色反应(＋＋)，角膜内皮细胞，虹膜有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋)，视网膜、脉络膜未见明显的兰色酶反应(－)。4组：虹膜、视网膜节细胞层存在β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)。5组：眼球内无β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(－)。

用药后2天，1组：β-半乳糖苷酶基因阳性表达部位同用药后1天，但阳性表达细胞数明显增加，尤其以光感受器层的阳性表达(＋＋)增加最为明显。2组：角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜节细胞层、光感受器层及色素上皮细胞均有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)，与用药后1天相比，阳性表达细胞数明显增加。3组：角膜上皮、内皮细胞、虹膜、睫状体内有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)，与用药后1天相比，阳性表达细胞数无明显增加，但视网膜节细胞层及光感受器层均可见阳性表达(±～＋)，脉络膜未见阳性表达(－)。4组：角膜上皮、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜节细胞层、内核层、光感受器层和色素上皮层均有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)。5组：眼球内各组织无β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(－)。

用药后1周(图1，2)、2周、1月，所有5组的β-半乳糖苷酶基因表达情况与用药后2天相同。

3讨论

研究结果表明，脂质体可转导外源基因到活体小鼠眼组织，如角膜、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜光感受器、视网膜节细胞和视网膜色素上皮细胞，不会导致眼球结构的改变和眼内炎症。由脂质体转导的β-半乳糖苷酶基因可在眼组织内表达至少1个月以上。通过玻璃体腔注射、尾静脉注射、表面点药及球后注射等不同途径给药，脂质体转导基因到眼组织，除表面给药组在脉络膜未看见到β-半乳糖苷酶基因的阳性表达外，其他β-半乳糖苷酶基因的阳性表达部位相同，仅有表<