摘要目的从蛋白质水平了解体外培养牛眼小梁细胞是否表达转化生长因子β(TGF-β)及其受体(TGF-βR)。方法采用Supervision法对体外培养第3代牛眼小梁细胞进行TGF-β₁，TGF-βR免疫组化检测。结果小梁细胞TGF-β，－β₂和TGF-βRⅠ，RⅡ，RⅢ免疫组化染色的阳性信号分别位于胞浆内和胞膜上，阴性对照未见阳性信号。结论牛眼小梁细胞表达TGF-β，TGF-βR蛋白。较之猪眼小梁细胞，牛眼小梁细胞更适用于今后研究TGF-β及其受体与原发开角型青光眼发病学的关系。

分类号R775

Expression of TGF-β and TGF-β receptors protein in cultured bovine trabecular meshwork cells

Cao Yang，Wei Houren，Fu Mingshui

（Department of Ophthalmology，Union Hospital，Tongji Medical University，Wuhan 430022）

AbstractObjectiveTo study whether cultured bovine trabecular meshwork cells express transforming growth factor-β(TGF-β) and TGF-β receptors(TGF-βR） in protein level．MethodsBovine trabecular meshwork cells were cultured in vitro and passaged 3 times，then the cells were transfered or cultured onto sterile cover lips，and the expressions of TGF-β and TGF-βR were detected with immunohistochemical technique-Supervision method．ResultsTGF-β₁，-β₂were significantly expressed in the cytoplasm of cultured bovine trabecular meshwork cells，and TGF-βR Ⅰ，RⅡ，RⅢ immunostain were positive on the membrane of the cells．No immunostaining was seen in the negative control．ConclusionThe presence of TGF-β and TGF-βR in cultured bovine trabecular cells were confirmed．Bovine trabecular cells may be more suitable to investigate the relationship between TGF-β，TGF-βR and primary open-angle glaucoma than porcine trabecular cells．

Key wordstrabecular meshwork cell，cultured transforming growth factor receptor，transforming growth factor glaucoma，open-angle

原发开角型青光眼(primaryopen-angleglaucoma，POAG)是常见致盲性疾病之一。小梁细胞数目异常减少，细胞外基质异常沉积是其主要病理改变^［1，2］。有研究表明，具有抑制小梁细胞生长^［3，4］、促其细胞外基质合成^［5，6］等作用的转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)在POAG患者房水中的浓度明显高于正常人，可能参与了POAG的发生^［7］。本实验拟对体外培养牛眼小梁细胞TGF-β及转化生长因子β受体(transforminggrowthfactor-βreceptors，TGF-βR)进行免疫组化研究，以利于进一步研究TGF-β及其受体与POAG发病学的关系。

1材料和方法

1．1牛眼小梁细胞体外培养和鉴定参见我科过去报道的方法^［8］

1．2制作细胞爬片

取第3代近融合小梁细胞，消化后传入预置消毒盖玻片的培养皿内，置37℃CO₂培养箱中培养至细胞生长近融合。取出盖玻片，用PBS充分浸洗，冷丙酮固定30min后，晾干。

1．3制作细胞涂片

第3代小梁细胞消化后制成细胞悬液，滴在消毒盖玻片上，自然干燥后，冷丙酮固定，晾干待用。

1．4免疫组化染色(Supervision法)

将细胞爬片和细胞涂片放入0.5%H₂O₂中30min，以消除内源性过氧化酶活性。蒸馏水洗3次，滴加山羊血清封闭液，室温下10min，以封闭非特异性抗源。甩去山羊血清，分别滴加兔抗人、大鼠、小鼠TGF-β₁，-β₂和TGF-βRⅠ，RⅡ，RⅢ单克隆抗体(美国Sigma公司产品)，4℃湿盒中过夜。第2天取出后用PBS洗3次，滴加Supervision过氧化物酶-山羊抗兔IgG(武汉Boster公司产品)，置37℃湿盒中30min，PBS洗4次，DAB显色，显微镜下观察至出现棕黄色阳性信号，水洗终止反应。苏木素轻度复染。梯度酒精脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，镜下观察拍照。阴性对照以PBS代替第1，2抗体，阳性对照分别选用皮肤和乳腺癌标本。

2结果

牛眼小梁细胞TGF-β及TGF-βR免疫组化染色呈阳性，其中TGF-β₁，-β₂棕黄色阳性信号位于细胞浆内，而TGF-βRⅠ，RⅡ，RⅢ的阳性信号位于细胞膜上，阴性对照未见阳性信号(图1～6)。

图1免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-β₁染色阳性(×200)图2免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-β₂染色阳性(×100)图3免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-βRⅠ染色阳性(×200)图4免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-βRⅡ染色阳性(×200)图5免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-βRⅢ染色阳性(×100)图6免疫组化Supervision法，小梁细胞阴性对照（×100）Fig．1TrabecularcellspresentedpositivereactionstoTGF-β₁withSupervisionimmunohistochemicalstain（×200)Fig．2TrabecularcellspresentedpositivereactionstoTGF-β₂withSupervisionimmunohistochemicalstain（×100)Fig．3TrabecularcellspresentedpositivereactionstoTGF-βRⅠwithSupervisionimmunohistochemicalstain（×200)Fig．4TrabecularcellspresentedpositivereactionstoTGF-βRⅡwithSupervisionimmunohistochemicalstain（×200）Fig．5TrabecularcellspresentedpositivereactionstoTGF-β RⅢwithSupervisionimmunohistochemicalstain（×100)Fig．6NegativecontroloftrabecularcellswithSupervisionimmunohistochemicalstain (×100)

3讨论

POAG是致盲的重要疾病之一，其具体发病机制至今仍不清楚。有研究表明，小梁网是引发POAG的关键部位，小梁细胞数目异常减少及细胞外基质异常沉积是该病的主要特征^［1，2］。业已发现，TGF-β在POAG患者房水中的浓度明显高于正常人，推测它可能与POAG的发病有关^［7］。

TGF-β家族由至少6种相对分子质量约25000的多功能多肽组成。可抑制多种内皮细胞的增殖，促进Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原纤维，纤维连接蛋白，弹力素及蛋白多糖等细胞外基质的合成和分泌^［3］，其作用是通过与细胞膜上相应的受体结合介导的，Ⅰ、Ⅱ型受体为高亲和力结合蛋白，通过其胞浆侧的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶参与胞内信号传导，Ⅲ型受体为高亲和力蛋白多糖复合物，自身无信号传导功能，其主要作用在于促进各亚型TGF-β与Ⅱ型受体结合^［9］。

已有人从猪、牛等动物和人眼的房水中检出TGF-β₁，-β₂，主要来源于虹膜、睫状体、角膜和小梁网等眼前节组织^［9］。用放射配体结合实验和流式细胞仪检测已证实TGF-βRⅡ、RⅢ存在于体外培养猪眼小梁细胞上^［3，10］。而人眼小梁细胞除表达Ⅱ、Ⅲ型受体外，还表达Ⅰ型受体^［4］。这些发现表明，TGF-β可以通过旁分泌和／或自分泌方式作用于小梁细胞，发挥抑制生长^［3，4］，促进细胞外基质合成的作用^［5，6］。其异常合成分泌或受体的异常上调将可能导致小梁细胞数目减少及细胞外基质异常沉积，从而引发POAG。

为便于下一步观察TGF-β对小梁细胞功能的影响，我们采用较S-P、SABC等免疫组化方法更为敏感，背景更清晰，操作更简便的Supervision法，对体外培养牛眼小梁细胞进行TGF-β和TGF-βR检测，结果发现牛眼小梁细胞表达TGF-β₁，-β₂和TGF-βRⅠ、RⅡ、RⅢ蛋白，与人眼小梁细胞一致。因此，我们认为牛眼小梁细胞较之猪眼小梁细胞似乎更适合作人眼小梁细胞的替代材料，用于今后研究TGF-β及其受体与POAG发病学的关系。

1，Alvarado J，Murphy C，Juster R，et al．Trabecular meshwork cellularity in primary open angle glaucoma and non-glaucomatous normals．Ophthalmology，1984，91∶564

2，Lutjen-Drecoll E，Shimizu T，Rohrbach M，et al．Quantitative analysis of ‘plaque material’ in the inner and outer walls of Schlemm’s canal in normal and glaucomatous eyes．Exp Eye Res，1986，42∶443

3，Borisuth NSC，Tripathi BJ，Tripathi RC．Identification and partial characteri