摘要目的探讨肌苷对中枢神经再生的影响。方法分离并制作均匀的视网膜神经节细胞(RGC)悬液，采用24孔培养皿培养，观察嘌呤类物质对RGC轴突生长及细胞存活的影响。结果(1)肌苷促使RGC轴突生长；腺苷只有水解脱氨生成肌苷才能促使轴突生长。(2)肌苷与6-硫鸟嘌呤(6-TG）可能竞争性作用于蛋白激酶N(PKN)调节轴突生长。(3)肌苷刺激RGC致GAP-43表达增强。(4)肌苷的细胞内信息传递通路可能通过有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK）、磷脂酰肌醇激酶（PI3K)两条途径起作用。结论肌苷在RGC神经再生中起积极的调节作用。

分类号R774

Inosine regulates axon regeneration in retinal ganglion cells

Jing Yun，Nina Irwin，Larry I．Benowitz

（Ender’s Research Lab．312 Laboratory for Neurosicence Research in Neurosurg，Children’s hospital，Harvard Medical school，Boston，MAO 2115，USA C Jing Yun，Presently in Beijing Tong Ren Hospital，Beijing 100730）

AbstractObjectiveTo investigate the involvement of purine in the development and regeneration of neurons．MethodsGoldfish were dark-adapted，and their retinas were dissected．Retinas were dissociated by gentle trituration．Repeated cycles of trituration and sedimentation yielded cultures nearly homogeneous in ganglion cells．Low-density cells in 24-well culture dishes were maintained in a serum free．Axonal outgrowth and survival of retinal ganglion cells (RGC) in response to purine were evaluated．Results（1） Inosine stimulated axon outgrowth from RGC．Adenosine must be hydrolyzed to inosine via adenosine deaminase to stimulate RGC outgrowth．In the presence of aenosine deaminase inhibitor （deoxycoformycin），adenosine not only failed to stimulate growth，but also cause （RGC） to die．(2) 6-Thioguanine 10μmol／L completely arrested axon outgrowth stimulated by AF-1 though not affecting cell survival．Inosine 100μmol／L reversed the inhibitory effects of 6-thioguanine on AF-1 cometitively and may stimulate growth by direct activation of protein kinase-N．（3） Inosine increased expression of GAP-43 in RGC．（4）In signaling transduction studying，PD 98059 and LY 294002，specific inhibitors to MAPKK and PI3K respectively，either alone blocked 50％ of growth by inosine，blocked 100％ growth by inosine if combined together．Inosine may therefore stimulate growth via MEK-1／2 and PI3K pathways．ConclusionInosine plays an important role in the development and regeneration of RGC．It suggests the possibility of a clinically therapeutic opportunity to be explored further in central nervous system neuron diseases．

Key wordspurine neurotrophic factor axogenesis retina

神经系统退行性疾病、脊髓损伤是困扰人类的神经系统常见病，均导致永久性神经功能缺失。对此，医学界一直缺乏有效的治疗手段。Benowitz实验室以视网膜神经节细胞(retinalganglioncells，RGC)再生作为研究中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)神经元再生的模型，在发现视神经胶质细胞分泌的轴突生长因子(axogenesisfactor，AF-1，AF-2／3）促进RGC轴突再生^［1，2］的同时，也对嘌呤、嘧啶类物质在调节CNS神经元轴突生长过程中的作用进行了系统的研究，本文就肌苷(inosine)在调节RGC轴突生长方面的突出作用及其细胞内调节机制进行探讨。

1材料与方法

1．1视网膜神经节细胞培养金鱼(CometVariety，Mt．ParnellFisheries，Mt．Parnell，PA)6～10cm长，避光30min，冰冻麻醉，分离视网膜。视网膜在含木瓜蛋白酶、半胱氨酸的消化液中消化45min，在L-15培养液中研磨3遍，上层2／5悬液为纯化RGC匀浆。用经聚赖氨酸涂层的24孔培养皿，细胞密度为每孔5×1000，培养液含胰岛素、牛血清白蛋白、庆大霉素、过氧化氢酶、转铁蛋白、超氧岐化酶、氢化可的松等，在21℃培养箱中培养5天。

1．2GAP-43免疫染色用新鲜4%福尔马林液固定细胞，100%甲醇去脂，第一抗体系兔IgG结合金鱼GAP-43，第二抗体系选用羊抗兔IgG抗体，在荧光显微镜下计数染色细胞。

1．3试剂AF-1由本实验室制备，终浓度20%～35%。肌苷、腺苷(adenosine)、次黄嘌呤(hypoxanthine）、5’－一磷酸肌苷(5’-inosinemonophosphate，5’-IMP)、腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase，ADA)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)、LY294002由Sigma公司提供。L-15培养液由GibcoBRL公司提供。2-Deoxycoformycin（DCF），PD98059来自Calbiochem公司。

1．4设计与检验每组试验均以AF-1为阳性对照，以L-15培养液为阴性对照，每个样本均分4份，样本与对照按随机化原则分布在24孔培养皿中，密码封存。5天后在400倍显微镜下，每孔计数不少于150个细胞，计数其中轴突长于5个细胞体直径的RGC数，以此计算平均生长率；计数所用视野数，以此计算平均存活率。应用CricketGraph软件(CAAssociates，Islandia，NY)计算生长率、标准误，然后对数据进行标准化处理。标准化平均生长率＝(样本平均生长率－阴性对照平均生长率)／(阳性对照平均生长率－阴性对照平均生长率)；标准化标准误＝样本标准误／(阳性对照平均生长率－阴性对照平均生长率)；平均存活率＝细胞总数／视野数。以CricketGraph软件作条图。采用配对计量资料t检验法。大多数实验均多次重复。

2结果

2．1肌苷调节RGC轴突生长AF-1是视神经胶质细胞分泌的一种小分子量轴突生长因子，能诱导RGC轴突显著生长，L-15培养液则无此作用^［1，2］。以这两种因素分别作为阳性与阴性对照，我们发现肌苷有刺激RGC轴突生长的作用，经多次试验，发现其有效半量浓度(E-50）是10～15μmol／L，25～50μmol／L达最大活性，相当于AF-1活性60%。肌苷代谢产物Hypoxanthine，5’-IMP，除5’-IMP在100μmol／L有较低活性(较肌苷10μmol／L活性还低)外，其余均无刺激轴突生长的作用(图1)。

^**P＜0.01^***P＜0.001

1嘌呤对RGC轴突生长的影响

Fig．1RGCregenerateaxonsinresponsetopurines

Aden(adenosine)，Ino(inosine)，Hypo(hypoxanthine)，5’-IMP

（5’-inosinemonophosphate)

^***P＜0.001

2腺苷脱氨后刺激轴突生长

Fig．2Adenosine，hydrolyzedviaADA，stimulatesoutgrowth

ADA（adenosinedeaminase）0.4U／mlandDCF（deoxycoformycin）10μmol／L腺苷也有刺激轴突生长的作用(E50＝10～15μmol／L)，50～100μmol／L达最大活性，相当于AF-1活性60%(图1)。腺苷在ADA作用下，水解脱氨生成肌苷。应用ADA抑制剂DCF(10μmol／L)抑制ADA活性，使腺苷不能脱氨，可看到腺苷(100μmol／L)不仅显著抑制轴突生长，还降低细胞存活率(P＜0.001)。外源性ADA(0.4U／ml)对腺苷引起的轴突生长及细胞存活率均无影响(图2)。提示腺苷刺激轴突生长的作用有赖于腺苷水解脱氨。

2．2肌苷刺激GAP-43表达增强已知GAP-43是与神经生长相关的一种膜磷脂蛋白。应用GAP-43多克隆抗体技术，依肌苷，AF-1，L-15培养液各组对GAP-43荧光染色的强度分3组(无反应、中度染色、高度染色)，结果显示AF-1，肌苷两组高度染色细胞数较阴性对照L-15组分别增加高达8倍、5.5倍，而3组均显示轴突长度与染色强度一致。提示肌苷促进GAP-43表达增强。

2．3肌苷与6-TG竞争性调节轴突生长6-TG是嘌呤同类物，在PC-12细胞，已经发现6－TG阻断神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)引起的轴突生长，但不影响存活率。我们发现10μmol／L6-TG可完全阻断AF-1引起的RGC轴突生长，不影响细胞存活；阻断25μmol／L肌苷作用的50%，对100μmol／L肌苷无抑制作用。令人惊奇的是，100μmol／L肌苷可完全扭转10μmol／L6-TG对AF-1的抑制作用，恢复AF-1活性至其原有高度，且扭转后达到的活性高度显著高于100μmol／L肌苷本身的活性高度。提示肌苷与6-TG之间可能竞争性通过某个同样的途径而影响轴突生长。

2．4肌苷可能通过的细胞内信息传递通路进一步对引起CNS神经元轴突生长的细胞内信息传递通路进行研究，发现在离体RGC，有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinasekinase，MAPK