摘要目的探讨异搏定(Verapamil)对体外培养兔角膜基质细胞分泌TGF-β₁的影响。为预防或减轻PRK后混浊(haze)形成提供线索。方法将传代培养细胞，在加药培养后48h，应用TGF-β₁E_max^TMImmunoAssaySystem试剂盒对培养上清中TGF-β₁含量进行检测，根据标准曲线分别计算出各孔TGF-β₁的浓度。结果Verapamil浓度5μg／ml和10μg／ml，作用48h，培养上清中TGF-β₁含量明显降低(P＜0．05)。Verapamil浓度越高，培养上清中TGF-β₁含量越少。结论Verapamil能明显抑制角膜基质细胞分泌TGF-β₁，可望成为预防或减轻PRK后haze形成的药物。

分类号R772

The effect of verapamil on the production of transforming growth factor-β₁ in

keratocytes in vitro

Zhong YishengZhou YingmingWang Kangsun

（Ophthalmic Center，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical

University，Shanghai 200025）

Abstract ObjectiveTo investigate the effect of verapamil on keratocytes in vitro for the production of transforming growth factor（TGF-β₁)，and make progress in pharmacological prevention or reduction of haze formation after PRK．Methods Cultured keratocytes were exposed to a different concentration of verapamil solution．TGF-β₁ production from supernatant was investigated by TGF-β₁ ImmunoAssay System after 48 h of verapamil exposure．The TGF-β₁ concentrations in supernatant were calculated by the TGF-β₁ standard curve．Results Verapamil （5μg／ml and 10μg／ml） can inhibit TGF-β₁ secretion of rabbit keratocytes after incubation for 48h（P＜0．05)．The inhibition effect of 10μg／ml verapamil was higher than those of 5μg／ml verapamil．Conclusion Verapamil can inhibit TGF-β₁ production from rabbit keratocytes，and might become a new drug for prevention of reduction of haze formation after PRK．

Key wordsverapamil transforming growth factor-β₁ keratocytes

准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractivekeratectomy，PRK)后角膜上皮下混浊(haze)形成与术后伤口愈合过程中角膜基质细胞增生活跃有关，因此，寻求抑制术后角膜基质细胞过度增生且副作用小的药物是一值得研究的课题。最近研究表明钙离子通道阻滞剂异搏定(Verapamil)具有明显抑制成纤维细胞增殖的作用^［1］，具有很好的应用前景但其抑制细胞增殖的确切机制尚未明了。本文旨在观察Verapamil对培养角膜基质细胞分泌转移生长因子β₁

(transforming growth factor-β₁，TGF-β₁)的影响，以期探讨其抑制角膜伤口愈合的部分机制。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1实验动物：3只体重约2．5～3kg新西兰白兔(雌雄不限)(中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供)，静脉麻醉后检查无眼疾。

1．1．2培养液：采用DMEM培养液，内含10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，10mmol／L Hepes，100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素，2.5μg／ml二性霉素B，pH＝7.2～7.4。

1．1．3试剂和仪器：Verapamil为上海禾丰制药有限公司产品，规格为5mg／2ml。TGF-β₁E_max^TMImmunoAssay System(Cat．No．G1230)试剂盒为Promega公司产品。仪器：Bio-RAD Model 450型酶标仪。

1．1．4药物终浓度：Verapamil 2.5、5、10μg／ml。

1．2方法

1．2．1细胞培养和药物加入

参照我们报告的方法进行兔角膜基质细胞培养^［2］，取2～3代角膜基质细胞，0.1%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸(ethylenediaminotetraacetic acid，EDTA)消化后，用DMEM培养液调整细胞浓度为2×10⁴／ml，接种于24孔培养板中，每孔1ml，于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h后，去除培养液，每孔加入新鲜培养液1ml，同时加100μl含不同药物浓度的培养液，使其终浓度达预定值，对照组加不含药物的培养液，每一处理因素做4个平行孔，继续CO₂培养箱中培养。

1．2．2培养上清TGF-β₁的检测

加入药物培养48h后，小心吸出培养上清，离心去除细胞残渣后，取上清进行TGF-β₁的定量测量。TGF-β₁的检测按照TGF-β₁ E_max^TM ImmunoAssay System试剂盒说明进行，同时绘制TGF-β₁标准曲线，终止反应后，用酶标仪测450nm吸光值。根据标准曲线，采用586计算机Microsoft Excel中Forecast函数分别计算出各孔TGF-β₁的含量，并进行统计学处理和作图。

1．2．3细胞数量检测

细胞培养过程中，每日用倒置显微镜观察各孔细胞增殖情况。药物作用48h去除培养上清后，采用0.1%胰蛋白酶及0.01%EDTA消化后，2%台盼兰染色行活细胞计数，以确定各孔存活细胞数量是否一致。

2结果

2．1细胞生长情况

各培养时期，加药物孔和未加药物孔细胞生长增殖情况相似；药物作用48 h后，各孔细胞已达基本融合状态。2%台盼兰染色检查各孔活细胞数量相似。

2．2Verapamil对培养角膜基质细胞分泌TGF-β₁的含量

Verapamil浓度为2.5μg／ml，作用48h，培养上清中TGF-β₁含量较对照组降低，但经统计学处理，无明显差异(P＜0．05)；浓度为5μg／ml和10μg／ml时，培养上清中TGF-β₁含量明显低于对照组，经统计学处理，均有显著性差异(P＜0．05)，且Verapamil浓度越高，培养上清中TGF-β₁含量越少(见图1)。

图1Verapamil作用48h后培养上清中TGF-β₁含量

Fig．1The concentration of TGF-β₁ in supernatant after verapamil exposure for 48h

3讨论

3．1TGF-β₁在角膜伤口愈合中的作用

TGF-β₁是一种多功能调节肽，它能促进或抑制细胞增殖、分化和细胞的功能。角膜上皮细胞和基质细胞中均有TGF-β₁和TGF-βRⅡ mRNA表达，因此TGF-β₁可以通过自分泌和旁分泌方式调节角膜上皮细胞和基质细胞增殖、分化的功能^［3］。TGF-β₁的作用主要是与其调节细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)，特别是调节Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原、纤维连接蛋白和氨基葡萄糖(GAG)的形成有关。其作用机制有^［3］：(1)增加ECM主要成分的合成；(2)降低ECM的蛋白降解；(3)调节结合素(integrin)受体的合成。TGF-β₁通过调节角膜基质细胞产生ECM而促进角膜伤口的愈合。TGF-β₁还通过调节其它细胞因子而间接调节着角膜基质细胞的增殖和分化，Hongo等^［4］报道TGF-β₁能促进培养兔角膜基质细胞高亲合型表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)的表达，因此增加细胞对TGF-α和EGF的反应敏感性而间接调节伤口的愈合；Leof等^［5］报道TGF-β₁通过促进血小板源性生长因子(PDGF)基因的表达而间接促进成纤维细胞的增殖。

3．2Verapamil对角膜基质细胞分泌TGF-β₁的影响

Verapamil为一经典的钙离子通道阻滞剂，最近研究证实它具有显著抑制眼内成纤维细胞增殖的作用，局部应用0.125%和0.25％Verapamil无明显毒副作用^［1，6］，越来越受到眼科界的青睐。我们通过实验发现Verapamil浓度＞10～1000μg／ml时，对培养兔角膜基质细胞具有明显抑制作用^［7］，为了对其作用机制有所了解，本实验着重观察了Verapamil对培养角膜基质细胞分泌TGF-β₁的影响。由于Verapamil浓度≤10μg／ml时，对角膜基质细胞无明显抑制作用，为了排除由于存活细胞数量的减少而致细胞分泌入培养上清中TGF-β₁减少，影响实验结果，故本实验选用Verapamil药物浓度为2.5、5、10μg／ml；同时培养结束后进行活细胞计数，进一步证实各药物浓度作用孔存活细胞数相似，更加增加了实验的可比性。本实验结果发现Verapamil能明显减少培养角膜基质细胞分泌TGF-