摘要目的对视网膜神经上皮移植后移植物的成活及发育情况进行初步观察。方法采用内路注射移植方法建立动物模型，行27眼移植手术。术后定期眼底检查，组织学检查和免疫组织化学检查。结果21眼移植成功，组织学检查可见移植后移植物可以成活，部分细胞呈花环状生长，可继续发育分层，未见明显的炎细胞浸润及免疫排斥现象。免疫组织化学检查可见移植物S-抗原染色阳性。结论视网膜神经上皮移植术后移植物可以成活并继续发育，无明显的炎性反应及免疫排斥现象。移植物可发育出光传导的物质基础。

分类号R774

An experimental study on retinal neuroepithelial transplantation

Wang WeiDong XiaoguangXie Lixin

（Institute of Ophthalmology，Shandong Academy

of Medical Science，Qingdao 266071）

Abstract ObjectiveTo observe the survival and development of retinal neuroepithelial transplantation in rabbits．MethodsTransplantations were performed in vitreous of 27 rabbit eyes．Postoperatively the fundi were examined．The eyes were removed，and histological and immunohistological study was made for fundi from 1 to 4 weeks after operation．ResultsThe transplantations in 21 eyes were successful．The transplants were developed and matured according to their intrinsic time．Transplanted cells formed rosetes．There were no inflammation and no rejection for at least 4 weeks．The transplants had anti-S-antigen reactivity．ConclusionsThe transvitreous retinal neuroepithelial transplants can survive and develop well．Moreover，the transplants can develop a key protein of the light transducing process．

Key wordsretinal neuroepithelial transplantation S-antigen

随着神经生物学的发展，有研究发现视网膜的神经轴突损伤后可以再生，重建突触联

系^［1］， 这使视网膜神经上皮的移植成为可能，本文采用直视下内路注射法建立了兔视网膜神经上皮移植的动物模型，并进一步研究移植术后S-抗原的表达，对移植细胞进行鉴定，得到初步结果，现总结汇报如下。

1材料与方法

1．1动物实验

受体为健康成年有色素兔35只，体重1.5～2.5kg，实验组27只，对照组8只。供体采用同种胎龄2周的胎兔。孕期2周(第15天)的母兔经氯胺酮过量麻醉后，无菌条件下取胎兔，置于4℃含Ca^2＋、Mg^2＋PBS中(pH＝7.4，葡萄糖1mmol／L)，立即在显微镜下摘除眼球，移入含上液的无菌培养皿中，去除眼前段，小心剪除玻璃体，可见视网膜神经上皮自行脱出，呈片段状，收集视网膜于4℃PBS液中即刻应用。

动物麻醉、消毒、开睑，角膜上加用角膜接触镜，角巩膜缘后2.5～3mm处避开血管，用微量注射器吸取供体视网膜组织颗粒约10μl，在显微镜直视下穿刺进入玻璃体腔，选择视盘周围有髓神经纤维束末端，将注射器头插入视网膜下腔，缓慢注入供体视网膜约10μl，小心退出针头，勿使移植物返流，视网膜无需处理，恢复球结膜，覆盖巩膜穿刺口。

1．2组织学检查及HE染色

取移植部位周围10mm×10mm组织片，平铺于滤纸片上，置快速固定液中固定约2h。常规病理切片及HE染色。

1．3免疫组织化学检测S-抗原

免疫组织化学实验采用美国ZYMED公司生产的SP_TM试剂盒(由北京中山生物技术有限公司提供)。1∶5000稀释S-抗原单克隆抗体(MAbF₄C₁由美国Wills眼科研究所Larry Donoso博士赠)。

2结果

2．1手术结果：实验组21眼(共27眼)，对照组6眼(共8眼)手术成功，术后未见并发症。

2．2组织学检查结果：移植前胚胎期2周供体视网膜，仅见单一多细胞层，富含细胞核，尚未见内外颗粒层的分化。移植术后1周移植区受体视网膜神经上皮与色素上皮分离，被移入的视网膜细胞失去原来正常的片段状排列，大部分呈花环状排列，花环由中央空腔及周围向心排列的细胞团组成，近中央处细胞核轻度椭圆状，深染，花环边周核圆，淡染(图1)。移植后2～3周：移植区可见两种细胞的继续分化分层，近中央区胞浆红染，形态类似外节，指向中央空腔，但较短。个别地方未形成花环，呈条形排列，可见内外核层分化，相当外节部分指向受体色素上皮层，也有朝向受体内界膜方向(图2)。4周移植物细胞排列仍大部分呈花环状，内外核层分化明显，在受体及植片之间可见核固缩细胞。实验组和对照组术后1～4周未见明显脉络膜血管扩张、充血，无淋巴细胞及单核巨噬细胞浸润。

图1花结样生长

Fig.1Rosette growing

图2片层样生长

Fig.2Film growing

2．3免疫组织化学结果：移植前供体胚胎期S抗原染色阴性。移植后1、2、3、4周移植物抗原染色可见棕红色颗粒，呈阳性反应(图3)，阴性对照未见染色。

图3S抗原染色阳性

Fig.3S-antigen staining was positive

3讨论

供体移植物按移植的形态可分为细胞移植和组织移植，前者即用酶将细胞分离，形成细胞悬液后移植。本研究采用的是组织移植，直接收集片段状视网膜组织，未经酶处理。胚胎2周兔视网膜仅有内外成神经细胞层(neuroblast cell layer)，尚无感光细胞的分化，至出生后1～2周由外成神经细胞层分化成内外颗粒层而出现感光细胞的发育^［2］，因此，内外颗粒层分化，是胎兔视网膜移植后发育的有利证据。本实验大部分植片在移植后3～4周(即相当于生后1～2周)，可见两种细胞的分化似内外颗粒层，外颗粒层细胞位于花环的中心，成向心性排列，内颗粒层位于花环周围。这说明移植后的细胞仍可在受体内按自身的发育过程继续发育。但可见少量感光细胞出现不同程度变性，位于受体及移植细胞之间，这些固缩核可能同时来自于受体及供体细胞，而移植部位附近的受体视网膜结构正常，分析可能的原因是移植部位的受体视网膜感光细胞失去与色素上皮的正常联系造成代谢的障碍而出现变性。

本研究在术后1周就发现移植细胞的排列大部分呈花环状。目前形成这种花环结构的机理尚不清楚，我们分析可能的影响因素有：(1)机械或手术因素对胚胎组织生长的干扰。体外培养的胚胎视网膜未见花环结构，而受到机械或其它因素干扰时出现花环结构^［3］，因此我们考虑移植手术本身可能造成胚胎视网膜生长中断或注射时组织卷曲排列。部分移植物并未排列成环状，而是成片层状，这种随机性的现象也可能归因于注射本身。(2)色素上皮的影响。色素上皮细胞在视网膜发育过程中可通过细胞因子诱导成神经细胞增殖分化，对感光细胞的发育起重要的调节作用^［4］，先天性色素上皮病变造成的视网膜营养不良，可以观察到感光细胞呈花环状排列，因此处于胚胎期的视网膜细胞移植入成熟体内，可能接受处于不同成熟程度的色素上皮的诱导而出现这种排列的异常。花环的形成使视网膜失去正常的排列及联结，不利于正常的光传导，因此今后有必要对移植物的生长进行长期的观察及对花环形成机理进行探讨。

S-抗原^［5］即终止蛋白(arrestin)，是分子量为50000的球形蛋白质，正常存在于视网膜感光细胞层中视杆及部分视锥细胞上，是感光细胞的特异性抗原，也是光传导过程的重要蛋白，通过与磷酸化的视紫红质结合参与光传导过程。移植前胚胎期视网膜由成神经细胞组成，S-抗原尚未发育，染色阴性，移植后1～4周，移植物的S-抗原染色阳性一方面说明移植的成神经细胞在受体内继续发育成感光细胞，达到移植的目的，同时也说明移植的感光细胞已具有了光传导的物质基础，为视供能的研究提供理论依据。

本研究没有发现明显的免疫排斥现象。分析原因可能与视网膜感光细胞Ⅰ类抗原表达较弱，几乎无Ⅱ类抗原表达有关。而视网膜神经上皮下的免疫赦免和前房免疫相关偏离也可能是免疫排斥发生率低的原因。但视网膜神经上皮层移植后长期的免疫状态等问题需要进一步的研究。

1，Caroline WL．Transplantation of human fetal retinal pigment epithelium rescues photoreceptor cells from degeneration in the Royal College of Surgeons rat retina．Invest Ophthalmol Vis Sci，1996，17∶204

2，Stone JE