摘要目的探讨FasL及pRb在视 网膜母细胞瘤中的表达及意义。方法用免疫组织化学SP方法检测45例视网膜母细胞瘤及 12例 正常视网膜组织中FasL及pRb蛋白的表达。结果视网膜母细胞瘤组织表达pRb ，比正常组织显著降低(P＝0.0009)。视网膜母细胞瘤和正常组织均高表达FasL。结论FasL的表达是贯穿视网膜母细胞瘤发生及发展过程中的一个重要事件，pRb低表达与肿瘤的发生有密切关系。

分类号R774.1

A study on the expre ssion of FasL and pRb in retinoblastoma

Kong LingfeiLiu ZhengguoYinPingzhangHenan

（Provincial Hospital，Zhengzhou 4 50003）

Abstract ObjectiveTo investigate the significance of FasL and pRb express ion in retinoblastoma．MethodsAll mater i als were archival formalin-fixed and par affin-embedded samples．Both FasL and pRb in 45 cases of retinoblastoma and 12 ca ses of normal retina were investigated．T he biotinylated second antibody and enz yme conjugated immunohistochemical stain ing technique was used．ResultsThe expr e ssion of pRb in retinoblastoma and norma l retina were 1.778±0.876 and 2.833±1.115，respec tively(P＝0.0009)，immunostaining for pRb i n normal retina were significantly highe r than that in the retinoblastoma．The ex pression of FasL in retinoblastoma and n ormal retina were 3.021±0.847 and 3.583±0.669，re spectively（P＝0.023)．Normal retina tissue stained very strongly positive for FasL and the retinoblastoma stained slightly weaker than the normal retina tissue，ex hibiting FasL was high-regulation in nor mal retina and retinoblastoma．Conclusio n High-regulation of expression of FasL i n retinoblastoma and normal retina sugge sted that it is a throughout event which implicated a novel mechanism immune esc ape．The decrease of pRb expression in re tinoblastoma is closely related to tumor pathogenesis．

Key wordsretinoblastoma Fas-L retinoblastoma protein apo ptosis immune escape

视网膜母细胞瘤是发生在儿童眼部的 一种常见恶性肿瘤，该肿瘤的发生与13q14的Rb等位基因的缺失或该位点等位基因的失活 有直接关系^［1～3］。Rb基因是目前公认的最早发现的抗癌基因，该基因产 物在很多肿瘤中有改变。Fas是一种细胞表面分子^［4］，可与其特异性配体Fa sL(CD95)结合，诱导细胞凋亡的发生。最新的研究表明，许多肿瘤细胞可表 达FasL，提示肿瘤细胞表达FasL可明显减弱Fas阳性细胞毒性淋巴细胞的攻击能 力，是肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的新机制，在肿瘤的发生和发展中起重要作用。FasL 在视网膜母细胞瘤中的表达的研究，目前在国内外均未见报道，本文拟在研究FasL和p Rb在视网膜母细胞瘤中的表达及与肿瘤发生发展的关系。

1材料与方法

1．1材料

研究对象：视网膜母细胞瘤45例及正常视网膜组织 12例(为1994年至1998年间存档蜡块)，标本处理前均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。

试剂：兔抗人FasL多克隆抗体(N-20）G（ 1∶300，Santa Cruz Co．），兔抗人Rb多克隆抗体(C-15）（1∶1 00，Santa Cruz Co．），SP试剂(biotinylated sec ondantibodyand enzyme conjugate，Zymed Laboratories Inc）均购置于中山生物技术公司，DAB（Immuno tech Co．）。

1．2方法

石蜡标本切4μm厚，经脱蜡，水化，消除内源性酶活性，血清封闭，分别加入一抗fasL(1∶300)和p Rb(1∶80)，在柠檬酸钠缓冲液中微波修复5min重复1次，4 ℃过夜；加入生物素化的二抗，室温孵育15min，再加入酶复合物，室温孵 育15min，DAB显色，苏木素复染。每例切片均由2位病理医生观察整个 切片，并根据阳性细胞的分布范围，分为：“0”表示阳性细胞数为0%，“1”表示阳性细胞 数1%～25%，“2”表示阳性表达细胞数在26%～50%，“3”表示阳性表达细胞数在51%～75% ，“4”表达细胞数在76%～100%。

阳性对照：Rb用肺癌组织中表达阳性的标本，Fas L用睾丸组织，结果均阳性。

空白对照：BPS代替一抗，结果均阴性。每次实验均设对照。

1．3统计学处理

数据用均数±标准差表示，比较两组之间表达的差异，用非配对t检验，取P＜0.01为差异有显著性的标准。

2结果

pRb在核内表达，染棕色或棕黄色，胞浆不着色，肿瘤 细胞灶状或散在阳性（1.778±

0.876），正常视网膜细胞表达均匀(2.833±1.115)(P＝0.0009)差 异具显著性。FasL主要在胞浆及胞膜上表达，核不表达，分布弥散(3.021±0.847)， 正常视网膜细胞全层表达(3.583±0.668)(P＝0.023)差异无显著性。FasL， pRb在视网膜母细胞瘤中的表达见图1，2。

1视网膜母细胞瘤和正常视网膜 中FasL的表达

Fig．1FasL exp ression in normal retina and retinoblastoma

2视网膜母细胞瘤及正常视网膜 中pRb的表达

Fig．2pRb expression in retinoblastoma and normal retina

3 讨论

凋亡是一个自主生理性细胞死亡过程，是机体自身稳定的重要调节机制，参与胚胎发生、组织塑型、造血调控、发育、衰老等生理过程。肿瘤的发生和发展与凋亡的关系密切。Fas／FasL系统是近年来认识较深入的与凋亡信号传递有关的系统。目前的研究资料表明，FasL在许多恶性肿瘤中有高的表达，如结肠癌^［5］，前列腺癌^［6］，恶性胶质瘤^［7］，肝细胞肝癌^［8］，胰腺癌^［9］等，认为肿瘤细胞表达FasL可诱导浸润淋巴细胞的凋亡，而使肿瘤细胞本身逃避免疫系统的监视和控制。近一步的研究显示，FasL表达阳性的TE-15食管癌细胞株与Fas敏感性JurkatT细胞淋巴瘤细胞株共同培养，可明显诱导后者凋亡的发生；相反，当与Fas抗性Jurkat细胞株共培养时，后者凋亡的发生明显减少，表明TE-15食管癌细胞株表达的FasL具生理活性，FasL的高表达是通过与Fas的相互作用导致Fas表达阳性的细胞毒性T淋巴细胞的发生凋亡，使其攻击作用减弱，是肿瘤逃避免疫攻击的重要机制^［10］。ThomasS等^［11］，在研究眼的免疫特赦功能时，把HSV-1注射到眼前房，观察到中性白细胞及淋巴细胞的浸润，但在注射后24h，可看到浸润细胞发生明显的凋亡，在正常情况下，HSV-1引起的炎症只局限在前房，很少波及后房，更不会影响视网膜；当把HSV-1病毒注入Fas^－的小鼠和FasL-的小鼠前房，均引起强烈的炎症反应但不伴随凋亡的发生，表明浸润细胞凋亡的发生依赖于功能性Fas及FasL的表达。并发现FasL在正常角膜上皮、角膜内皮、睫状体及视网膜全层均有强的表达，是免疫特赦的物质基础。本研究结果显示，FasL在正常视网膜组织和肿瘤组织中均高表达，是贯穿视网膜母细胞瘤发生发展过程的一个事件，可以这样理解，在正常时FasL参与免疫特赦，而在肿瘤时，则可认为参与肿瘤的免疫逃逸；其高表达可能是视网膜母细胞瘤逃避免疫攻击的途径之一，有利于视网膜母细胞瘤的失控性增生，在肿瘤的发展中起重要作用。

Rb基因表达产物为110000分子量蛋白，由于蛋白磷酸化的程度不同^［12］，可表现为112000，114000两种形式，该蛋白参与DNA合成及细胞周期的调节，负性调节细胞生长。在许多恶性肿瘤中呈低表达。本实验结果显示，在正常视网膜组织中，pRb表达均匀，而在视网膜母细胞瘤中，则表达明显减弱，表明pRb在视网膜母细胞中抑制细胞增生的作用减弱，在肿瘤的发生上起重要作用。最近的研究表明，pRb的断裂出现在细胞受UV照射或加入抗Fas抗体发生凋亡时，pRb特殊部位的断裂是凋亡发生的重要事件^［13］。本实验中，肿瘤细胞表达pRb的量明显减少，推测pRb特殊部位的断裂发生较少，有抑制凋亡发生的作用。但pRb与凋亡关系的研究还有待进一步深入。

1，Lee WH，Shew JY，Hong FD，et，al．The retin oblasto ma susceptibility gene encodes a nuclea r phosphoprotein associated with DNA bin ding activity．Nature，1987，329∶642

2，Lee WH，Bookstein R，Hong F，et al．Huma n retinoblastoma susceptibility gene：clo ning，identification and sequence．Science ，1987，235∶1394

3，Cooper JA，Pet er W．R etinoblastoma and the cell cycle：entranc e or exit？Cell，1989，58∶1009