摘要目的观察角膜内皮细胞(CEC)对淋巴细胞活化和增殖的抑制活性，并分析其机制。方法通过植片技术分离大鼠和兔CEC。在CEC单层上，观察淋巴细胞对丝裂原刀豆蛋白A(Con A)和同种异体抗原刺激的增殖反应。另外，将CEC培养上清直接转移到由Con A刺激的淋巴细胞增殖系统以观察CEC释放某些因子的抑制效应。结果CEC对Con A或同种异体抗原刺激的淋巴细胞增殖反应可以施加有效的抑制效应。在这些检测系统中所观察到的抑制效应不具有MHC限制性。将CEC培养上清直接转移到由ConA刺激的淋巴细胞增殖系统，并未观察到显著的抑制效应。然而，当CEC培养上清经过浓缩和酸处理后，则在胸腺细胞共刺激实验中显示剂量-反应形式的抑制效应。结论CEC通过细胞交互作用和(或)释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。CEC可能是构成眼前房免疫赦免的因素之一。

［眼科新进展 1999；19(3)∶145-148］

Inhibition of corneal endothelial cells on lymphocyte activation and proliferation induced by mitogen

LI Zhi-Jie,LIN Jian,LI Chen

AbstractObjectiveTo investigate the inhibitory activity of corneal endothelial cells(CECs) on lymphocyte activation and proliferation,and to analyze its mechanism.MethodsThe CECs were isolated from rat and rabbit corneas by explant technique.On the monolayers of CECs,the proliferation reaction of lymphocytes to Concanavalin A(Con A) and alloantigens were investigated.In addition,CEC culture supernatant was transferred directly into the lymphocyte proliferation system stimulated by Con A to observe the inhibitory effects of factors released by CECs.ResultsCECs exerted a potent inhibitory effect on in vitro proliferation system of lymphocytes stimulated by Con A or alloantigen.The inhibitory effects that observed in these assays were not MHC-restricted.The CECs culture supernatant was transferred directly into the proliferation system of lymphocytes stimulated by Con A,but significant inhibitory effect was not observed.However,when the supernatant from CECs was concentrated and treated by acid activation,it exhibited the inhibitory effect of the thymocyte costimulation assays in dose-response way.ConclusionsCECs have potent inhibition effect on lymphocyte activation and proliferation by cell interaction and/or some inhibitory factors,and would take a role in contributing to the immune privilege of anterior chamber.

Key wordscorneal;endothelial cell;immune privilege;immunoregulation;anterior chamber-associated immune deviation;cell culture

［Rec Adv Ophthalmol 1999;19(3)∶145-148］

眼前房具有独特的免疫学特征，针对抗原刺激，可诱导全身性抗原特异性迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)的抑制，但保留正常的体液免疫反应和细胞毒T细胞反应。我们将该现象称为前房相关免疫偏离(anterior chamber-associated immune deviation,ACAID)^［1］。ACAID的诱导与眼部独特的免疫微环境有着密切的关系。已证实，虹膜睫状体细胞可直接抑制淋巴细胞的增殖和活化；房水含有许多免疫抑制因子，包括转化生长因子-β(TGF-β)、血管活性肠肽、α-黑素细胞刺激激素和其它尚未辨明的小分子多肽，对抗原和丝裂原诱导的淋巴细胞增殖具有显著的抑制作用^［2，3］。本文旨在观察内衬前房前壁的角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CEC)对淋巴细胞活化和增殖的调节效应，并对其相关机制进行了讨论。

1材料和方法

1.1CEC的培养及条件培养基的制备使用植片法建立大鼠和兔角膜内皮细胞原代和传代培养^［4］。在24孔板选择生长良好汇合的传代细胞。在12h内使用无血清IMDM培养基换液3次以去除残留的培养基。然后，每孔加入新鲜无血清培养基2mL，继续培养，每24h收集上清1次，共收集3次。2000r·min^-1×10min，离心上清，去除细胞碎屑，加入1g·L^-1牛血清白蛋白(FBS)。使用3.47u分子截流量透析袋透析浓缩25倍，-20℃冻存。在使用前分2组。其中一组进行酸激活处理：取200μL浓缩的培养上清，加1.5μL 6mol·L^-1 HCl使pH≤3.5，在22℃孵育5～30min，然后加30μL中和缓冲液，然后按1∶4加入5mL·L^-1FBS-RPMI1640培养基稀释，以备进行胸腺细胞增殖试验检测活性。

1.2Con A诱导的脾淋巴细胞增殖^［5］断颈处死Lewis大鼠，无菌取脾，筛网研磨制备单细胞悬液，调整细胞浓度至5×10⁹个·L^-1，使用96孔培养板，每孔加细胞100μL，再加入Con A至终浓度为2.5mg·L^-1。5mL·L^-1 CO₂，37℃培养48h。每孔加［³H］-TdR50μCi(20μL)，继续培养24h。自动细胞收集器收集细胞，液闪计数测定同位素掺入量，结果用cpm表示。

1.3混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)^［6］分别处死Lewis大鼠(反应细胞)和Wistar大鼠(刺激细胞)，筛网研磨制备脾脏单细胞悬液，调整细胞浓度至0.5×10⁹个·L^-1。使用96孔板，每孔加反应细胞和刺激细胞各100μL。37℃孵育5d，每孔加50μCi(20μL)［³H］-TdR，继续培养24h。收集细胞，液闪测定cpm。

1.4胸腺细胞增殖反应^［7］无菌制备C3H/HeJ小鼠胸腺单细胞悬液，调整细胞浓度至30×10⁹个·L^-1。使用96孔板，每孔加细胞悬液50μL，加10μL 100000U·L^-1重组人白细胞介素1β和50μL PHA(4mg·L^-1)，最后加连续3倍稀释的CEC条件培养基待测样品100μL，每个样品设3个复孔。37℃，6mL·L^-1CO₂孵育72h，每孔加50μCi(20μL)［³H］-TdR。继续培养18h，收集细胞，液闪测定cpm。

2结果

2.1CEC对丝裂原激活脾细胞的抑制作用在Con A存在下，脾淋巴细胞发生显著的增殖效应。但将Con A加脾细胞在CEC单层上共育时，则增殖反应显著减弱。但直接转移CEC培养上清对脾细胞的增殖则未见显著影响(见图1)。

Figure 1Inhibition effect of CECs on lymphocyte activation and proliferation

CEC对丝裂原刺激的淋巴细胞活化和增殖的抑制

2.2非MHC和非种系限制性抑制使用来自Lewis或Wistar大鼠的CEC，对来自Wistar或Lewis大鼠Con A激活的脾细胞具有同样的抑制作用。使用兔眼的CEC同样也可观察到对Lewis大鼠脾细胞的抑制(见图2)。

Figure 2Effect of MHC-restriction on splenocyte proliferation

MHC限制性对脾细胞增殖反应的影响

2.3与CEC共育对淋巴细胞活性的影响分别将与CEC共育2、4、6d的脾细胞转移到空白孔，加入终浓度为2.5mg·L^-1 Con A后，脾细胞的增殖反应可以恢复正常。

2.4CEC对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用在CEC存在时，MLR受到显著抑制(占50%)，CEC培养上清无显著抑制效应(图3)。

Figure 3CECs effect of mixed lymphocyte reaction

CEC对混合淋巴细胞反应的影响

2.5CEC培养上清酸激活后对胸腺细胞增殖的影响CEC培养上清经透析浓缩后，发现未处理的样品对IL-1协同刺激的胸腺细胞增殖无显著影响。经酸激活的样品可观察到浓度相关的抑制趋势(图4)。

Figure 4Inhibition effect of CECs culture supernatant which was acid-treated on thymocyte proliferation

CEC培养上清酸处理后对胸腺细胞增殖的抑制效应

3讨论

最近，Obritsch等^［8］证实CEC对抗原特异性T淋巴细胞系的增殖和活化具有强