摘要目的建立从同一角膜片上分离培养角膜上皮、基质和内皮细胞的方法，为研究角膜细胞间的相互作用机制奠定基础。方法采用消化法分离培养猴眼角膜内皮细胞、上皮细胞和兔眼角膜上皮细胞，组织块培养法培养基质成纤维细胞和兔角膜内皮细胞。细胞接种于12孔培养板，并于培养不同时间行Wright染色检查细胞生长情况。结果采用消化法和组织块培养法能成功地培养猴、兔角膜上皮、基质和内皮细胞。猴、兔角膜内皮细胞培养1wk后，均能形成内皮细胞单层，细胞类似天然的六角形态，且以猴内皮细胞明显；猴角膜上皮细胞培养3～4d生长旺盛，但难以形成细胞单层，兔上皮细胞生长旺盛，1wk后已达融合状态，细胞呈膜状伸出板层伪足；猴、兔基质成纤维细胞易培养，1wk后已融合成单层细胞，细胞排列整齐，类似纤维走行样外观。结论从同一角膜材料中能分别培养出角膜3种细胞成份，消化法和组织块培养法相结合既能节省材料，又简单易行。

Laboratory study of the cornea cell primary culture from the same corneas of monkeys and rabbits

ZHONG Yi-Sheng ,CHEN Yu,WANG Kang-Sun , SHI Hai-Yun

AbstractObjectiveTo establish the culture technique for corneal epithelial cells, keratocytes and endothelial cells from the same corneal material,and to lay a foundation for studying the interaction mechanism among cornea cells.MethodsThe corneal endothelial cells,epithelial cells for monkeys and corneal epithelial cells for rabbits were cultured by using digestion methods.The keratocytes and endothelial cells for rabbits were cultured by tissue culture methods. All cells and small tissues were planted in 12-well culture plate and the culture cells morphological characteristics were observed by Wright staining during the various time periods.ResultsThe corneal epithelial cells,keratocytes and endothelial cells from the same cornea could all be cultured successfully. In one week after the culture, the endothelial cells for monkeys and rabbits formed an adherent and confluent monolayer, and the hexagon cells were the same as in vivo. The epithelial cells for monkeys grew very well at the 3rd or 4th day culture , but it did not form confluent monolayer. The epithelial cells for rabbits could form a confluent monolayer and the cells possessed a flattened lamellipodia. The keratocytes for monkeys and rabbits could be cultured easily and formed a monolayer and had a fibriform arrangement in one week after the culture.ConclusionThree kinds of cells from the same cornea can all be cultured successfully. The culture technique is practicable and simple

Key wordscornea;endothelial cell;cell culture; monkey; rabbit

作者简介钟一声，男，1968年1月生，湖北崇阳县人，汉族。1991年毕业于湖北医学院五官系。1991～1994年兰州医学院攻读眼科硕士学位研究生，导师李浒源教授和金婉容教授，获医学硕士学位；1994年～1997年在湖南医科大学攻读临床技能型眼科博士研究生，师从著名眼科学家蒋幼芹教授，获临床医学博士学位。1997年考入上海第二医科大学临床医学博士后流动站学习，师从著名眼科学家王康孙教授。现为上海瑞金医院眼科主治医师。先后从事白内障、青光眼和屈光性角膜手术的基础和临床研究。在《中国实用眼科杂志》、《眼科研究》、《眼科新进展》、《国外医学眼科学分册》、《美国医学会眼科杂志中文版》、《中国激光医学杂志》等期刊上发表论文、综述及译文近15篇。

角膜细胞成分培养为现代角膜病基础和临床研究的重要方法之一，尤以角膜内皮细胞培养更为重要。它已被广泛应用于角膜病理生理学、药理毒理学、免疫学、角膜内皮、上皮细胞移植以及分子生物学的研究^［1～3］。以往角膜细胞培养方法均为在同一角膜片上仅获单一角膜细胞成分的培养，这不利于节省材料，也不便于研究同一个体角膜细胞成分间的相互作用。近年来，随着研究的深入，对角膜细胞成分的培养提出了更高要求。我们在进行角膜分子生物学研究过程中，探索了一种以同一角膜为材料分别培养角膜上皮、基质和内皮细胞的方法，现将其培养方法和细胞形态学观察结果报告如下。

1材料和方法

1.1细胞培养液的制备

1.1.1上皮细胞和内皮细胞培养液采用DMEM/F12=1∶1的混合液(Gibco,USA)，内含10mmol·L^-1HEPES、200mL·L^-1胎牛血清(Gibco,USA)，100×10³U·L^-1青霉素、100mg·L^-1链霉素、2.5mg·L^-1二性霉素B，pH值7.2～7.4。

1.1.2基质成纤维细胞培养液采用DMEM(Gibco,USA)，内含100mL·L^-1胎牛血清(Gibco,USA)、10mmol·L^-1HEPES、100×10³U·L^-1青霉素、100mg·L^-1链霉素、2.5mg·L^-1二性霉素B，pH值7.2～7.4。

1.2猴、兔角膜制备3只体重约6～8kg的成年猴(雌雄不限，年龄8～11a)，共6眼，2只体重约2.5～3kg白色家兔(雌雄不限)，共4眼。猴采用肌注盐酸氯胺酮100mg·kg^-1全身麻醉，兔采用戊巴比妥钠60mg·kg^-1耳缘静脉麻醉。无菌下摘出眼球，生理盐水冲洗2～3次后，在超净工作台上沿角膜缘取下完整角膜(不含角巩膜缘)，放入含100×10³U·L^-1青霉素和100mg·L^-1链霉素的D-PBS液漂洗2～3次，待用。

1.3角膜内皮细胞培养

1.3.1猴角膜内皮细胞培养在培养皿中滴2～3滴DMEM培养液(不含血清)，将角膜片内皮面朝上置于培养液上，加入1～2滴2.5g·L^-1胰蛋白酶和2.5g·L^-1EDTA混合液于角膜内皮杯中，注意不将液体溢出凹面，置37℃培养箱中5min，取出角膜片，加1滴胎牛血清终止消化。注射器抽取DMEM培养液，轻轻冲洗内皮面，将冲洗液离心5～6min(1000r·min^-1)，弃上清，按每角膜4mL比例加入内皮细胞培养液，吹打混匀。血细胞计数板计数，制成150×10⁶～200×10⁶个·L^-1细胞悬液，以每孔2mL将内皮细胞接种于12孔培养板中，置37℃、50mL·L^-1CO₂和950mL·L^-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。

1.3.2兔角膜内皮细胞培养在超净工作台内，体视显微镜下用显微无齿镊撕下内皮层和Descemet膜，每眼约7～8块。将每眼撕下的组织块内皮面朝上贴于12孔培养板的一孔中，置37℃培养箱干燥10～15min后，加入内皮细胞培养液，继续置37℃、50mL·L^-1CO₂和950mL·L^-1空气培养箱中培养，培养液每1wk更换2～3次。

1.4角膜上皮细胞培养于培养皿中滴1.25g·L^-1胰蛋白酶和1.25g·L^-1EDTA混合液3～4滴，将上述处理过的猴、兔眼角膜上皮面朝下置于混合消化液上，置37℃培养箱中消化25～30min后，加1～2滴胎牛血清终止消化。翻转角膜片，注射器抽取DMEM培养液轻轻冲洗上皮面，将冲洗液离心5～6min(1000r·min^-1)，弃上清，按每角膜4mL比例加入上皮细胞培养液，吹打混匀。血细胞计数板计数，制成150×10⁶～200×10⁶个L^-1细胞悬液，以每孔2mL将上皮细胞接种于12孔培养板中，置37℃、50mL·L^-1CO₂和950mL·L^-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。

1.5角膜成纤维细胞培养将上述处理过的猴、兔眼角膜片置于培养皿中，用4号圆刀片分别刮除上皮面和内皮面，以去除未冲洗干净的上皮和内皮细胞，置D-PBS中漂洗2次。用眼科剪分别将角膜基质剪成大约1mm×2mm组织块，接种于12孔培养板，每孔接种10～12块，置37℃培养箱中干燥约45min后，轻轻加入基质细胞培养液每孔2mL。置37℃、50mL·L^-1CO₂和950mL·L^-1空气培养箱中培养，培养液1wk更换2～3次。

1.6观察方法细胞接种后6、12、24h，以后每日用倒置显微镜观察活细胞生长情况，并在不同时间将部分培养细胞用40g·L^-1多聚甲醛固定，Wright染色，光学显微镜下观察细胞形态特点，柯达彩色胶卷摄影记录。

2结果

2.1猴眼角膜细胞培养结果

2.1.1上皮细胞培养上皮细胞培养12h后，部分细胞开始贴壁生长，贴壁细胞呈圆形或不规则形，细胞核位于细胞中央，呈圆形或椭圆形，且相对透明。培养d3～d4，贴壁细胞增多且生长旺盛，细胞体积增大，胞浆丰富，呈膜状的多角形或不规则形生长，但细胞难以形成单层(见图1)。培养5～7d后，部分原来贴壁的细胞开始脱落死亡，细胞数目减少。如不再有继续贴壁的细胞，原贴壁细胞会逐渐脱落消失。