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Effect of 4-pyrone-3-β-D-glucopyraoside on rat retinal neurons in vitro
ZHONG Yi-Sheng, JIANG You-Qin
From the Department of Ophthalmology, Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011 Hunan Province,China
AbstractObjectives To observe the effect of 4-pyrone-3-β-D-glucopyraoside(PGP),one of the main integrants of Erigeron Breviscapus(Vant.) Hand-Mazz, on rat retinal neurons in vitro and to find out its nontoxicity concentration for cultured retinal neurons.MethodsThe retinae of 6 postnatal 2～3 days Sprague-Dawley rats were dissociated into cell suspension with trypsin digestion. The cell suspension was implanted in 96-well culture plates covered with murine-tail collagen in each well(1×105 cells/well). The concentrations of PGP solution were 1g·L-1～10-5g·L-1. The period of culture was 1,3 and 5 days respectively, Then, the OD of living cells in each well was tested by MTT colorimetric microassay. Some of the 5-day culture cells were identified by Nissel technique.ResultsThe retinal neurons cultured in the well coated by murine-tail collagen tissue grew very well. Some cells processed axons and some axons connected network form. Most of the living cells were retinal neurons by Nissel identification. The morphological contour of cultured retinal cells showed nosignificant changes in each concentrations of PGP. However, the numbers of cells and OD decreased significantly at the concentrations of above or equal to 10-2g·L-1(P＜0.01～0.05)；The number of cells and OD decreased slightly under thisconcentration (P＞0.05).Conclusion PGP has no direct effect on retinal neuron growth in vitro, and it has no toxicity on cells under the concentration of 10-3g·L-1.
Key words retinal neuron;cell culture;4-pyrone-3-β-D-glucopyraoside青光眼是以视盘呈典型凹陷及视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)死亡为特征的眼病，其损伤机理尚未明确。目前青光眼的治疗主要是降低眼压，而对视网膜神经细胞的保护尚无有效药物。灯盏细辛治疗眼压已控制的晚期青光眼具有扩大或保持患者视功能(视力、视野)的作用已经临床观察证实［1，2］，在大鼠急性高眼压时具有提高RGCs细胞色素氧化酶的作用已经实验证实［3］。最近，Quigley［4］提出了治疗青光眼的新观点，应从保护RGCs损伤着手，并提出了可能存在的2种途径：应用神经营养因子治疗青光眼和用药物控制RGCs凋亡基因的表达。本文应用灯盏细辛的主要成份之一4-吡喃酮-3-β-D-吡喃葡萄糖甙(4-pyrone-3-β-D-glucopyraoside, pGP),观察其是否具有类似神经营养因子的作用，并筛选出其有效的药物浓度，现报告如下。
1材料和方法
1.1材料6只生后2～3d的Sprague-Dawley大鼠眼球由湖南医科大学实验动物中心提供。4-吡喃酮-3-β-D-吡喃葡萄糖甙(PGP)粉剂由云南药物研究所提供，用DMEM培养液分配成浓度为4g·L-1、4×10-1g·L-1、4×10-2g·L-1、4×10-3g·L-1、4×10-4g·L-1、4×10-5g·L-1，均在临用前配制。
1.2细胞接种培养和PGP加入方法
1.2.1鼠尾胶原的制备参照王子淑 ［5］介绍的方法制备鼠尾胶原。
1.2.2培养板处理用吸管将胶原液均匀涂于96孔培养板(Coster,USA)后，向孔内充入氨气片刻，待胶原与氨气作用30min后胶原凝固，然后用D-Hank液反复冲洗，晾干后即可使用。
1.2.3细胞悬液制备将乳鼠颈椎脱位致死，消毒后轻轻摘出眼球，置入含100×103U·L-1青霉素和100mg·L-1链霉素的D-Hank液内漂洗3次。显微镜下沿角膜缘剪除角膜，去除晶状体和玻璃体，然后钝性分离出神经层视网膜组织。用D-Hank液漂洗视网膜3次，置入0.8g·L-1胰蛋白酶(Sigma产品)37℃消化30min后，加入100mL·L-1小牛血清的DMEM液终止消化。将上清液300r·min-1离心3～5min后，弃上清液，加入培养液(800mL·L-1DMEM，200mL·L-1胎牛血清，葡萄糖6g·L-1，青霉素100×103U·L-1，链霉素100mg·L-1，二性霉素2mg·L-1，氯化钾25×10-3mol·L-1，Hepes10×10-3mol·L-1)约8mL，钝头吸管吹打使之成为细胞悬液，行细胞计数，调整培养液量使每mL含1.3～1.4×106个细胞。
1.2.4接种培养和PGP加入方法将细胞悬液接种于已处理的96孔培养板内，随机分为培养1、3、5d组，每孔约75μL细胞悬液(每孔含细胞数约100×103个)，每组又分6个亚组，分别加入DMEM(对照组)和各种浓度PGP溶液(Ⅰ～Ⅵ实验组)25μL，分别使每亚组PGP浓度为0、1g·L-1、10-1g·L-1、10-2g·L-1、10-3g·L-1、10-4g·L-1、10-5g·L-1。置于50mL·L-1CO2培养箱内37℃培养。12～24h后，加入5-溴-2’-脱氧尿苷(20mg·L-1，Sigma,USA)以抑制非神经细胞生长，48h后，更换培养液，d5组换液时仍按上法加入PGP继续培养。
1.3观察指标
1.3.1形态学观察应用Olympus倒置显微镜每天行活细胞观察。
1.3.2Nissel染色检查采用缓冲亚甲蓝法(Pischinger法)［6］对培养5d的细胞行Nissel体染色检查，以确定存活细胞中神经细胞的量。
1.3.3MTT微量自动比色法［7］取培养1、3、5d的96孔培养板细胞，分别每孔加入MTT20μL(2.5g·L-1，0.15mol·L-1 PBS pH=7.4)，继续培养4h后，小心吸去培养上清液，用0.04mol·L-1盐酸异丙醇每孔120μL终止反应，振荡5min，室温静置30min后，用ELISA仪(EL 312e型，USA)测光密度OD值。实验波长为570nm，每孔测3次，取其平均值。
2结果
2.1形态学观察经胰蛋白酶消化获得的视网膜神经细胞静置在覆有鼠尾胶原的培养板内4～6h开始贴壁，24h细胞基本完全贴壁，单层排列，部分细胞聚集成团，细胞呈圆形或椭圆形，核圆且相对透明，少数细胞接种1d后胞膜上伸出短而小的突起；72h后，少数细胞形成典型细胞突起，且少数突起相互连接；5d后有明显突起的细胞增多，细胞部分死亡，细胞数目明显减少。实验组中，Ⅰ～Ⅵ组培养1、3、5d细胞形态与对照组无明显差异，除Ⅰ、Ⅱ组细胞数量明显较同期对照组少之外，其余4组细胞数目与同期对照组未见明显差异。
2.2Nissel体染色检查应用缓冲亚甲蓝法行Nissel体染色，神经细胞染成蓝色；培养5d时，胞膜完整的细胞中大部分为Nissel体阳性染色细胞，表明存活细胞大部分为神经细胞。
2.3视网膜神经细胞存活的定量观察培养1d时，Ⅰ、Ⅱ组细胞存活的OD值明显低于对照组，差异有显著性(P＜0.001和P＜0.05)；Ⅲ～Ⅵ中，除Ⅲ组OD值高于对照组外，其余均低于对照组，但与对照组相比均无显著性差异(P＞0.05)。见表1。
表1PGP对培养1d的视网膜细胞生长影响的定量测量
