摘要利用单克隆抗体AE₅与分化型角膜上皮细胞中角蛋白K₃特异性结合，研究缺乏分化标志特征的角膜上皮干细胞定位特点，应用免疫组织化学方法显示K₃阳性表达的区域分布于除角膜缘上皮基底部以外的所有角膜上皮细胞中，角膜上皮干细胞存在于角膜缘基底部AE₅抗体反应阴性细胞中，即角膜干细胞位于角膜缘上皮层基底部。

分类号R392.31

Studies on the localization of corneal epithelial stem cells／Zhang

li．．．∥Ophthalmol cHN．-1999，8（1）.-53～55（Department of Ophthalmology，Third hospital，Beijing medical University，Beijing100083） To explore the location of corneal epithelial stem cells，A64000-mol-wt corneal keratin designated K₃ keratin，represented a marker for an advanced stage of corneal epithelial differentiation and had an epitope for AE₅．AE₅，a monoclonal antibody，can combine with the differentiated marker protein．We demonstrated that k₃ keratin was located in all cell layers of corneal epithelium，but only in the suprabasal layers of the limbal epithelium．The fact that epithelial basal cells of central cornea，not those of the limbus，possessed k₃ keratin indicated that corneal basal cells were in a more differentiated state than limbal basal cell．Limbal basal negative cells contained the least differentiated cells．Corneal epithelial stem cells were located in the corneal limbal basal cell layer．

Subject termsCornea；Epithelium；Stem cells Immunoassay Immuno histochemistry

临床某些眼表疾病，如反复性角膜上皮剥脱、复发性翼状胬肉、化学烧伤后的纤维血管翳性混浊、蚕蚀性角膜溃疡等疾病均与角膜干细胞功能紊乱有关^［1］。为探讨角膜上皮干细胞定位特点，我们进行了角膜上皮细胞角蛋白K₃表达的免疫组化研究，为防治因干细胞缺乏所致的顽固性眼表疾病提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物

健康新西兰白兔，雌雄不限，体重2.0～4.0kg。北京医科大学实验动物中心提供。

1.2主要实验试剂与仪器

鼠抗兔角膜上皮角蛋白抗体AE₅（T-TSun实验室惠赠）；ABC试剂盒（美国VectorLab公司产品，包括正常马血清，羊抗鼠血清，生物素-卵白素复合物，即ABC）；四盐酸3.3-二氨基联苯胺（DAB）；5％PBS-BSA；快速制片处理仪；奥林巴斯光学显微镜。

1.3实验方法

1.3.1角膜(包括角膜缘)组织石蜡切片制备

动物空气栓塞致死，立即摘除眼球，0.1MPBS洗净血污。角膜缘后5mm环行切开眼球，弃后节。角膜中央部、周边部、角膜缘及其邻近结膜、巩膜组织取材，纯酒精固定48hr，二甲苯透明10min，置快速制片处理仪中，浸蜡（56℃）15min，包埋，切片，厚度5μm，37℃恒温箱中孵育。

1.3.2ABC法免疫组织化学染色石蜡切片经二甲苯、乙醇顺序脱蜡至水，置3％H₂O₂中，室温30min。0.1MPBS漂洗，5min，3次。切片置湿盒中，滴加单克隆抗体AE₅（鼠抗兔抗体，5％PBS-BSA稀释，工作抗体滴度1∶100），原北京医科大学第三临床医院研究生，现在北京市第四医院，100062北京医科大学第三临床医院4℃过夜。PBS漂洗，5min，3次。滴加第二抗体(羊抗鼠血清，1∶500），反应1hr。PBS漂洗5min，3次。滴加第三抗体（ABC1∶500），反应1hr。PBS漂洗5min，3次。Tris-HCl（0.05MpH7.6）漂洗5min，滴新配置DAB-H₂O₂于组织上，光镜下观察显色，3～5min。冲去DAB终止反应，2％甲绿复染，光镜下观察细胞核呈蓝色。脱水、透明、中性树脂胶封片，光镜下观察并摄片。

1.3.3阴性对照组设置特异性抗体(第一抗体)对照组，以PBS代替单克隆抗体AE₅，余步骤同1.3.2

2结果

ABC法免疫组化实验，经酶作用底物显示组织抗原阳性为棕色染色。本实验单克隆抗体AE₅与角膜上皮角蛋白K₃特异性结合。角膜阳性染色细胞显示K₃抗原表达。经2％甲绿复染显示特异性染色物质K₃位于细胞质中。

实验结果显示，上皮阳性染色区域分布于除角膜缘基底细胞以外的所有角膜上皮细胞中(包括角膜缘基底上层细胞)，对照组（特异性抗体AE₅阴性对照）角膜及角膜缘上皮均阴性。

K₃免疫阳性反应细胞中可见圆形或椭圆形棕色标记颗粒。随细胞层次改变，棕色标记颗粒密集程度不同，即K₃表达强度不同。角膜中央部与周边部上皮，越近表层，标记颗粒越密集，越近基底，颗粒越稀疏，K₃表达强度呈表层向基底层纵向减弱趋势(图1中已显示此变化规律)，中央部向角膜缘部基底上层细胞(同一水平层次)亦呈逐渐减弱趋势(图1、图2分别示角膜中央部、周边部、角膜缘部基底上层细胞K₃表达强度横向水平逐渐减弱)。

角膜缘基底部可见数个散在或排列整齐的一排阴性染色细胞，阴性染色细胞缺乏K₃表达(图2中显示角膜缘基底上层上皮细胞K₃阳性表达，角膜缘基底部K₃表达阴性)。

3讨论

所有自我更新的组织中都有干细胞的存在，干细胞是成熟机体中具多潜能、自我维持、细胞周期长、能够进行不对称细胞分裂、缺乏分化特征、形态和生化上处于原始幼稚阶段的细胞。干细胞是细胞自我更新、增殖和分化的源泉^［1］。

角蛋白(keratin)是构成细胞支架系统中间纤维的五种蛋白组成成分之一。关于中间纤维在细胞分化中不同表达的变化已积累了相当多的事实。干细胞在生理和病理条件下向一定的功能表型转化，这种获得分化能力的细胞具有不同于干细胞角蛋白类型表达^［2］，抗角质蛋白抗体检测角蛋白表达，提供细胞分化依据。

K₃（亦称64K）是分化状态较高的角膜上皮标志蛋白。Schermer等^［3］研究发现，培养的角膜上皮陆续表达三对角蛋白：50／58K、48／56K、55／64K。细胞增殖多层次后，基底上层主要表达55／64K角蛋白，早期表达50／58K的“基底细胞”分离并加入生长因子刺激后，培养晚期也表达55／64K。

本实验发现，角膜上皮细胞(包括基底细胞)及角膜缘基底部以上细胞均呈K₃抗原阳性表达，而角膜缘基底细胞则呈阴性表达，角膜缘上皮层基底部呈阴性染色的细胞缺乏分化标志特征蛋白表达，是上皮细胞中原始幼稚的细胞，角膜缘基底部包含了最低分化细胞。

角膜缘上皮层基底部阴性染色、不表达K₃的细胞在角膜上皮增殖与分化中充当干细胞的角色，即干细胞位于角膜缘基底部，该结论与Schermer等学者实验研究结论相符^［3］。

病变损伤角膜缘，造成干细胞缺乏和／或功能紊乱，导致角膜表型上皮不能维持。临床中某些眼表疾病，如眼表瘢痕性类天疱疮、Stevens-Johnson综合征、反复性角膜上皮剥脱、复发性翼状胬肉、化学烧伤后的纤维血管翳性混浊、蚕蚀性角膜溃疡、先天性无虹膜症的角膜表层病变、与戴角膜接触镜相关的眼表上皮病变、良性遗传性角膜内角化不全等均与原发或继发性干细胞缺失和／或功能紊乱有关。Kohji等^［4］研究了先天性无虹膜症的眼表异常发现，在被检查的16个无虹膜症患者中，所有病例均表现角膜混浊、新生血管生长、缺乏角膜缘的Vogt栅栏结构，并通过印迹细胞学发现角膜周边部的杯状细胞显著增加。这项研究表明，无虹膜症的角膜表面有结膜上皮的侵入正是由于角膜上皮干细胞缺乏。

角膜干细胞位于角膜缘上皮层基底部为角膜缘移植手术提供了理论依据，而角膜缘移植后上皮重建，眼表改善又进一步证实了干细胞是上皮细胞增殖与修复的源泉。角膜缘移植术分自体和异体角膜缘移植，自体角膜缘移植片取自健眼，适用于病变仅累及单侧眼病例。由于有些不可避免的累及双眼的病变或对侧“健眼”有轻微的或亚临床病变，只能采取异体角膜缘移植，异体角膜缘移植片取自尸体供眼或病人亲属活体组织。

如角膜供体取自病人亲属的活体角膜，需先作HLA相容性检查。切除病变角膜缘全周，或上下方角巩膜缘板层，去除角膜上皮及纤维血管组织，以备植床。自体或异体角膜缘移植片5～10mm，宽度2～3mm，延伸到透明角膜区0.5～1mm，并超过角膜缘外2mm。将植片缝合于植床上。术后戴治疗性软性接触镜^［5］。

Copeland和Char^［6］报告了结膜鳞状细胞癌切除后自体角膜缘移植重建术。Jenkins等^［7］报告应用角膜缘移