in a Patient With Normal-Pressure Glaucoma

Martin B. Wax, MD; Glgn Tezel, MD; P. Deepak Edward, MD

目的：研究一例具有较完整的临床和实验室检查结果的正常眼压性青光眼患者的眼组织病理改变。

方法：具有视网膜蛋白单克隆球蛋白病和血清免疫反应物的正常眼压性青光眼患者尸体眼组织病理检查,并将其与年龄相匹配的对照者比较，同时研究实验室改变与临床病理之间的关联。

结果：患者的临床和组织病理结果包括视神经海绵状变性和特征性视神经凹陷均与高眼压的青光眼患者相似。另外我们还发现了视网膜的神经节细胞内、外核层有免疫球蛋白G和免疫球蛋白A的沉积，并用终端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿核苷末端标记技术发现了凋亡的视网膜细胞。

结论：最新发现了正常眼压性青光眼患者视网膜蛋白血清抗体和视网膜免疫球蛋白沉积，可能有助于更好地解释正常眼压性青光眼患者青光眼性视神经病变的根本机制。

青光眼性视神经病变是以视网膜神经节细胞及其轴突丢失、视乳头凹陷及视野敏感性进行性丢失为特征的。虽然临床研究已表明一些危险因素，包括高眼压（IOP）在青光眼性视乳头病变中的作用^1，2，但仍有20%～25%的青光眼性视乳头病变发生于眼压正常的患者³。尽管已有一些原发性开角型青光眼患者的眼组织病理报告^4～7及一些用高眼压的眼模型进行的实验研究^8，9，但正常眼压性青光眼的病理改变是否与高眼压的青光眼患者相似仍不清楚。在这里我们报告了1例正常眼压性青光眼患者的临床和死后组织病理结果，包括免疫球蛋白沉积在视网膜的迹象并用终端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿核苷末端标记技术观察了视网膜细胞的凋亡¹⁰。

材料和方法

临 床 表 现

1例74岁的白人妇女被诊断为正常眼压性青光眼并随访5年。最初的诊断依据为房角开放，不用抗青光眼药物眼压不超过20mmHg。进行性青光眼性视野改变和视杯改变，无其他可能引起视神经病变的原因。用核磁共振作神经眼科检查以排除其他视神经病变的病因（包括脑膜病变、感染、炎症、缺血、脱髓鞘病或压迫性病变）。她有冠状动脉疾患和青光眼家族史。在随访的最后2年中，为了把眼压降得更低并阻止青光眼视神经病变的进展，她接受了局部β-受体阻滞剂治疗。

在最初的日曲线眼压测量（6 Am至5 Pm间3次测量及5 Pm至6 Am间3次测量）及每3～6个月复查时的压平眼压测量中，眼压从未超过20mmHg。用视野分析仪30-2程序（Humphrey Instruments, San Leandro, Calif）进行了视野检查。最初的视野缺损特征为双侧鼻侧阶梯和左眼固视点附近的深的旁中心暗点。这些缺损在青光眼变化可能性分析中与基础视野比较有进展。图1显示了患者去世前1年时的视乳头立体照相及第一次和最后一次视野检查（间隔为5年）。患者具有双侧大陷凹（左眼大于右眼）并在随访中进一步扩大。在常规视乳头检查中双眼均可见反复的视乳头出血。患者还有双侧严重的视乳头旁脉络膜萎缩，由α区和β区组成¹¹。吲哚绿血管造影和荧光血管造影早期可见乳头旁区脉络膜毛细血管非灌注区。眼底荧光血管造影显示了与乳头旁萎缩α区相对应的窗样缺损。其中有视网膜色素上皮的色素和结构改变。其中位于颞下视乳头边界附近的一个非充盈区与乳头旁萎缩较重的区域（β区）相对应。在荧光血管造影的后期，在延伸到视盘的乳头旁严重萎缩区域内的先前的非灌注区中可见荧光渗漏（图2）。

图11例正常眼压性青光眼患者的青光眼性视神经病的临床表现。右眼（A和B）和左眼（C和D）的视乳头立体照相；右眼（E）和左眼（G）的首次30°视野结果；以及右眼（F）和左眼（H）5年随访期间的视野进展情况，固视点消失，假阳性，假阴性，瞳孔大小，及波动如下：E：分别为，5/28，0/17，2/17，5.5mm和1.62dB;F：分别为9/33，0/20，3/19，5.0mm和2.13dB;G：分别为0/27，0/18，2/16，5.0mm和3.04dB，及H：分别为8/24，0/19，1/14，5.0mm，和1.68dB

图21例正常眼压性青光眼的视乳头旁萎缩。A和B，右眼吲哚绿血管造影显示视乳头旁缺血区域。该眼眼底荧光血管造影显示视乳头旁α萎缩区有一窗样缺损及靠近颞下视乳头边界（C）的β区内有一充盈缺损。D，晚期荧光渗漏至视乳头旁萎缩的β区和视乳头。E，视乳头旁区的组织病理表现，有视网膜色素上皮和邻近光感受器及脉络膜毛细血管的严重损害（箭头）（苏木精-伊红染色：原大×100）

实验室研究发现除了抗牛心脂素抗体外还有IgA-λ副蛋白血症，提示存在体液自体免疫的异常。为了研究血清中可能存在的抗视网膜抗体，我们用以前描述的视网膜酶解物作免疫斑点试验¹²。Western blot分析和酶联免疫吸附试验结果表明存在有高滴度的抗几种视网膜蛋白的循环抗体，包括视紫红质和热休克蛋白（hsp）。抗视网膜hsp抗体包括直接抗人和细菌hsp60、hsp27和αA-晶体蛋白（图3）。

图3正常眼压性青光眼的Western blot分析结果。每条包含患者血清（稀释，1∶1000）抗小牛视网膜上清液（BRS）、小牛视网膜膜（BRM）（15μg/条），纯化的αA-和αB-晶体蛋白，热休克蛋白（hsp）27，细菌（B）和人类（H）hsp60，和视紫红质（3μg/条），如图所标。二抗（半抗人IgG）稀释1∶2000

方法

取出正常眼压性患者和作为对照的72岁的无眼病和神经病史的白人女性的双侧眼球。所有眼均在死后4小时内取材并在12小时内进行处理。所有眼均用10%甲醛固定、石蜡包埋。眼球从视神经远端至赤道部进行冠状面切片，做4μm厚的连续切片。部分切片用苏木精-伊红染色并在光镜下检查。部分切片用来识别凋亡细胞或进行免疫组化分析。

凋亡细胞的识别采用TUNEL技术，这是一种识别凋亡的原位末端标记技术，包括形态学检查和DNA分段2个主要步骤¹⁰。这是一种能准确并快速地识别凋亡细胞群并进行定量的敏感而特异的方法。采用原位细胞死亡检测装置（Boehringer, Mannheim, Mannheim, Germany）。将脱石蜡的切片放在荧光标记的核苷酸和来自小牛胸腺的终端脱氧核苷酸转移酶（TdT）混合液中孵育1小时，TdT将标记的核苷酸催化聚合成DNA片断的游离的3'-脱氧末端。此过程结束时我们用荧光显微镜（Olympus, Tokyo, Japan）来观察凋亡细胞。用不含TdT的荧光标记核苷酸混合液孵育的切片作为阴性对照。以曾用DNAse I(1mg/mL)处理以使DNA链断裂的切片作为阳性对照。

我们对切片作了下列检查，用Alcian蓝识别粘多糖、用Masson三色计勾画出神经胶质增生的轮廓，用Luxol last蓝脱去视神经的髓鞘，用磷钨酸苏木精识别血管壁上纤维蛋白的沉积，用刚果红检查血管周围的淀粉样沉着。

我们还用抗人IgG和IgA 抗体进行了免疫组化分析来了解免疫球蛋白沉积在视网膜和视神经的情况。为进行免疫染色，将脱石蜡切片用K蛋白酶（20μg/ml）室温下孵育20分钟。然后用3%牛血清蛋白处理标本37℃下30分钟以阻断非特异结合部位。冲洗几遍后,用抗人IgG和IgA荧光结合单克隆抗体37℃孵育1小时（稀释1∶16）（Sigma Chemical Company, St Louis, Mo）。孵育结束时，将切片冲洗几次并用荧光显微镜检查。以年龄相匹配的健康人眼和抗鼠免疫球蛋白抗体作为阴性对照。

结果

这例正常眼压性青光眼患者的视神经乳头和视网膜组织病理改变在左眼比右眼重，这与视乳头临床表现一致。双侧视神经乳头有明显的凹陷，具有筛板的排列紊乱、受压及后突等特征。通过视神经乳头的轴突数目减少并存在坚实的束状细胞外基质。然而在正常眼中筛板表现为规则的水平排列。正常眼压性青光眼患者的双眼视神经用Alcian蓝染色有空隙提示有Schnabel海绵状变性（图4）。在乳头旁的区域中，视网膜色素上皮、脉络膜毛细血管和光感受器均有萎缩（图2）。