中华眼科杂志2000年第36卷第4期

薛蔚杜蜀华李勇黄恺

摘要目的研究牛眼小梁细胞中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在不同压力下的mRNA表达及蛋白质合成的变化，探讨一氧化氮（nitric oxide，NO）在青光眼发病中的作用。方法培养新生牛眼小梁细胞，并分别给予20、40、60及80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)的压力，以不加压组为对照组，用原位杂交和还原型辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)组织化学染色技术对小梁细胞iNOS的mRNA和蛋白质含量变化进行定性及定量观察。结果牛眼小梁细胞中iNOS mRNA 及蛋白质含量均随压力增高而增高。对照组与压力20 mm Hg组比较，两组iNOS mRNA均为弱表达，组间差异无显著性(t=0.950 1,P＞0.05)；压力40 mm Hg和60 mm Hg组与对照组相比差异有显著性(t值分别为0.038 1和0.0324,P＜0.05)；压力80 mm Hg组与对照组相比差异有非常显著性(t=0.00016,P＜0.01)；压力40 mm Hg组与60 mm Hg组相比，组间差异无显著性(t=0.1123,P＞0.05)，而与80 mm Hg组相比差异有非常显著性(t值分别为0.0029和0.004 5,P＜0.01)。NADPH组织化学染色结果与原位杂交结果基本相同，仅显示40 mm Hg组与60 mm Hg组的组间差异有显著性(t=0.042 0,P＜0.05)。结论压力可激活iNOS mRNA表达，由此产生过量的NO可损伤小梁细胞，成为导致或加重青光眼的因素之一。

关键词：小梁网；一氧化氮；原位杂交；免疫组织化学

一氧化氮（nitric oxide, NO）是近年来受到广泛重视的小分子物质，人们在研究过程中发现，它具有十分复杂的双重性，既是不可缺少的神经递质、免疫活性物质，又具有细胞毒性作用。NO在眼球内广泛分布并参与多种病理生理过程。以往的青光眼研究结果提示在不抑制房水生成的情况下，NO能改善房水流畅系数，以降低眼压；NO神经元广泛分布于房角及视网膜神经纤维层，而青光眼患者小梁网和睫状体处的NO神经纤维比正常人明显减少；NO可通过多种途径，如增加自由基和细胞内Ca²⁺浓度，对视网膜神经节细胞产生直接毒性作用。因此，我们以体外培养的牛眼小梁细胞为模型，用原位杂交及组织化学染色方法，研究压力对诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）mRNA的表达及蛋白质合成的影响，并初步探讨其与青光眼发病的关系。

材料与方法

一、小梁细胞的培养

新生小牛宰杀后立即取出眼球，在6 h内按王林等^［1］及Hernandez等^［2］的培养方法进行小梁细胞培养。于角膜后缘5 mm处环形剪开眼球，去除玻璃体、晶状体及葡萄膜，在解剖显微镜下找到小梁网，用眼科镊顺其方向撕下海绵状小梁网(撕下小梁网后，在角巩膜交界处可见位置很浅的巩膜内沟)，将小梁网剪成细小的碎块，放入含20％小牛血清的RPIM-1640培养基中进行小梁细胞培养。将第3～5代细胞消化后，传代于铺满小盖玻片的培养瓶中，待细胞长满80％后，用于制备高眼压模型。

二、波形蛋白免疫组化染色

一抗为小鼠抗人和小鼠抗动物波形蛋白多克隆抗体，二抗为与生物素结合的兔抗小鼠抗体，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。免疫组化染色的主要操作步骤：用3％ h₂O₂室温孵育培养的小梁细胞5～10 min，以灭活细胞中内源性酶，蒸馏水洗3次。复合消化酶消化5～10 min后，再用蒸馏水洗3次，滴加正常小牛血清封闭液，室温放置20 min。滴加1∶100稀释的特异性一抗工作液，37℃下孵育30～60 min或4℃下过夜。PBS洗3次后，滴加生物素标记的二抗工作液，37℃下孵育20 min。DAB(dimethylaminoazobenzene)室温显色。最后以酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。

三、高眼压模型

密闭培养瓶，用空针从培养瓶塞中注入无菌空气加压，同时从与培养瓶相通的压力表中直接读取压力值。压力分别为20、40、60及80 mm Hg。在37℃恒温下培养24 h。

四、原位杂交

iNOS探针购自德国Beohringer Mannheim公司。探针的标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。主要操作步骤：细胞标本用4％多聚甲醛固定后，依次用PBS浸洗、0.2 mol/L HCl处理、4 mg/L蛋白酶K消化、甘氨酸浸洗后，37℃预杂交1～2 h，以2 mg/L的探针浓度配成杂交液，在42℃恒温水浴中杂交36 h，其后分别经梯度递减的系列标准柠檬酸盐溶液漂洗，再置入地高辛抗体工作液（1∶1000）中，37℃下1 h，分别依次用PBS、缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅲ漂洗，加入新鲜配制的显色液，室温避光显色1～2 h，用缓冲液Ⅲ终止反应，最后用酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。

1．原位杂交阴性对照：在杂交前需用RNA酶（10⁵ u/L）于37℃下预处理细胞标本30 min，杂交液中不加标记探针。

2．原位杂交阳性对照：杂交前不用RNA酶处理标本，杂交探针用β-actin。

五、还原型辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）组织化学染色方法：将新鲜牛眼小梁细胞标本用4％多聚甲醛固定，以0.01 mol/L PBS漂洗5 min，共2次；在下列配置的新鲜工作液中反应1 h：1.5 mg NADPH（上海生物制品研究所产品），0.375 mg四硝基唑蓝（nitroblue tetrazolium, NBT，美国Sigma公司产品），1.5 Tris-HCl缓冲液（含0.25% triton X-100）；双蒸馏水终止反应；明胶玻片贴片，晾干；常规脱水、透明、封片。

六、图像分析及统计学方法

将各组原位杂交和免疫组化染色标本置显微镜下取20个细胞，用TJTY-300型全自动医学图像分析系统测吸光度A值，以SAS软件分别对测得的数据进行统计学处理。

结果

一、小梁细胞形态特点

小梁组织块接种5～7 d后，小梁细胞开始从组织块周围长出，贴壁并向远处移行。原代细胞形态大小不一，传代后细胞形态逐渐趋于一致。小梁细胞核仁明显，细胞表面有长短不一的突起，有绒毛状皱褶，有些细胞呈扇形散开（图1）。随着细胞传代次数增多，小梁细胞形态逐渐紊乱，甚至重叠生长。

图1相差显微镜下活的小梁细胞×200

二、波形蛋白免疫组化染色结果

小梁细胞波形蛋白染色为阳性，胞浆呈棕黄色（图3）。

图2小梁细胞波形蛋白免疫组化染色阳性×100

三、原位杂交检测iNOS mRNA的表达

iNOS mRNA的表达呈蓝色颗粒，主要分布于胞浆及核仁。对照组小梁细胞有较弱的杂交信号（图3）；加压组iNOS mRNA表达呈随压力增高而逐渐增高的趋势（图4，5）。全自动图像分析结果（以吸光度A值表示）：对照组为0.1108±0.010 9,加压20 mm Hg组为0.111 0±0.005 7,加压40 mm Hg组为0.157 0±0.0072,加压60 mm Hg组为0.162 5±0.007 6,加压80 mm Hg组为0.189 4±0.010 8。对照组与加压20 mm Hg组相比，吸光度A值差异无显著性（t=0.095 1,P＞0.05）；与加压40、60 mm Hg组相比，A值差异均有显著性（t值分别为0.038 1和0.0324,P＜0.05）；与80 mm Hg组相比，A值差异有非常显著性（t=0.00016,P＜0.01）；40 mm Hg组与60 mm Hg组相比，A值差异无显著性（t=0.1123,P＞0.05）；而60 mm Hg组与80 mm Hg组相比，A值差异有非常显著性（t=0.0045,P＜0.01）。

图3不加压组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交，呈弱阳性×200

图4压力为60 mm Hg组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交×200

图5压力为80 mm Hg组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交×200

四、NOS蛋白质NADPH染色

NOS蛋白质NADPH染色阳性颗粒呈蓝色，仅分布于胞浆中（图6）。对照组亦有一定量的表达，加压组的蛋白质含量随着压力的增高而增高。图像分析结果（以吸光度A值表示）基本与mRNA表达相同：对照组为0.1412±0.001 3,加压20 mm Hg组为0.147 9±0.005 5,加压40 mm Hg组为0.171 0±0.0062,加压60 mm Hg组为0.182 4±0.007 0,加压80 mm Hg组为0.200 6±0.008 9。仅加压40 mm Hg组与60 mm Hg组吸光度A值差异有显著性（t=0.042 0,P＜0.05）。结果提示压力可刺激小梁细胞合成NOS，并在压力逐<