关键词： Parkinson病；肾上腺髓质；移植；异体；生物相容性材料；大鼠

【摘要】目的观察微囊化牛嗜铬细胞(BCC)大鼠脑内移植的效果及微囊的作用。方法将微囊化或非微囊化BCC和空微囊分别移植于帕金森病(PD)样大鼠脑纹状体内，观察术后阿朴吗啡诱发大鼠异常旋转行为的变化；用蔗糖-磷钾酸-乙醛酸(SPG)荧光染色和HE染色观察脑组织中植入的BCC及微囊的状态。结果空囊组PD样大鼠异常旋转行为改变不明显(n=6，P＞0.05)；非微囊组16只PD样大鼠中9只大鼠移植后1周旋转圈数下降到移植前的44.0%～60.9%(P＜0.01)，移植6个月时仍有BCC在部分受体脑内存活，移植区有较明显的炎性反应，另有7只PD样大鼠移植后异常旋转行为无明显改善(P＞0.05)，其脑内未见存活的BCC，移植区有较明显的炎性反应；微囊组16只PD样大鼠移植后旋转圈数下降到移植前的17.6%～35.6%(P＜0.01)，移植后10个月时大鼠脑内仍存在大量存活的微囊化BCC，无明显的炎性反应。微囊化BCC移植改善PD样大鼠异常旋转行为的效果明显优于非微囊者(P＜0.01)。结论BCC脑内移植可改善PD样大鼠的异常旋转行为；大鼠旋转行为的改善与BCC在脑内的存活状态有关；海藻酸钠及多聚赖氨酸制作的微囊可降低异种BCC移植的排斥反应发生率。

Microencapsulated bovine chromaffin cell xenotransplants into hemiparkinsonian rats

GAO Junmao, XUE Yilong, QI Zengfei, et al. Institute of Basic Medical Sciences, PLA General Hospital, Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo observe the immune separation effects of micro-capsules from alginate-polylysine-alginate(APA)in the rat cerebral transplantation of bovine chromaffin cell(BCC) grafts.MethodsMicroencapsulated BCC, non-microencapsulated BCC or empty microencapsulated BCC were grafted into the striatum of the hemiparkinsonian disease(PD)-like rats respectively. The abnormal rotational behavior induced by apomorphine was observed in the rats after operation. At the end of experiments the rats were killed and transcardially perfused with 300 ml normal saline. The brains were removed and frozen sections were cut in coronal plane on a freezing microtome. The BCC grafts and micro-capsules in the brains were observed under a fluorescent microscope after SPG staining and HE staining.ResultsThe changes in abnormal behavior of PD-like rats in empty microencapsulated graft group were not significant in 10 months(P＞0.05). Among the 16 PD-like rats in non-microencapsulated graft group, 9 rats had an improvement of abnormal rotational behavior one week after transplantation, with the rotations being decreased to 44.0%～60.9% of pregrafting in non-microencapsulated BCC graft group (P＜0.01). At the 10th month of postgrafting there were a large number of survival BCC in the host striatum with only minimum host reaction in microencapsulated BCC graft group. On the 6th month of postgrafting there was some survival BCC in the host corpus striatum accompanied by inflammatory response in non-microencapsulated BCC graft group. There was a significant difference in apomorphine-induced rotational behavior between microencapsulated BCC graft group and non-microencapsulated BCC graft group (P＜0.01).ConclusionTransplantation of BCC into brain can improve the abnormal rotational behavior in PD-like rats, which was correlated with the survival of BCC in the host brain. The micro-capsules from APA can decrease the host immune response to the heterogenic BCC grafts.

【Key words】Parkinson diseaseAdrenal medullaTransplantation, heterologousBiocompatible materialsRats

一些动物实验和临床研究已证实，脑内移植多巴胺(DA)能细胞可改善帕金森病(PD)的症状^［1］。我们的研究也说明牛肾上腺髓质嗜铬细胞(BCC)作为异种DA能细胞，可部分纠正PD样大鼠异常旋转行为。但异种移植的免疫排斥反应等问题限制了研究的发展。本实验以来源广泛的BCC作为异种DA能细胞，用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)制成的微胶囊包裹BCC，以建立免疫隔离屏障。分别将微囊化和非微囊化BCC移植于PD样大鼠脑纹状体内，观察移植前、后PD样大鼠异常旋转行为的变化及BCC在受体脑内存活的状态，以判断APA微囊在脑内移植中的免疫隔离效果。

材料与方法

一、材料

1. 动物：6-羟基多巴损毁右侧黑质的PD样大鼠46只(雌性SD大鼠，体重180～220 g)。

2. 试剂：6-羟基多巴(6-OHDA)，阿朴吗啡，海藻酸钠，多聚赖氨酸，蔗糖-磷酸钾-乙醛酸(SPG)，乙二醇甲基丙稀酸树脂(GMA)，聚乙二醇(PEG)，过氧化苯甲酰，N，N-二甲基苯胺等，以上均为Sigma公司产品。

二、方法

1. BCC的分离和纯化：取热缺血小于1小时的黄牛肾上腺，除去腺体外脂肪及筋膜，从肾上腺静脉中灌注乐氏液，洗净血液。然后用1 g/L胶原酶液灌注，37 ℃振摇，30分钟。机械分离出髓质组织，放入1 g/L胶原酶内再消化30分钟。170目网过滤，滤过液在4 ℃下1 500 r/min离心5分钟，再用平衡液重复2次。将沉淀物用含10%牛血清的DMEM液37 ℃下培养12小时，将未贴壁的细胞悬液转入新的培养瓶内继续培养，以去除贴壁的成纤维细胞。台盼蓝染色法检测细胞存活率。

2. BCC的微囊包裹：将BCC悬浮于14 g/L海藻酸钠液中，用静电液滴发生器(加拿大多伦多大学生理系SUN实验室)将其喷入100 mmol/L氯化钙液中以形成海藻酸钙珠；用0.5 g/L多聚赖氨酸包裹，再用1.4 g/L的海藻酸钠包裹；最后用1 mmol/L柠檬酸钠液化微胶囊核心。置DMEM培养液(含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素)中在5%CO₂、37 ℃孵育箱内培养待用。每个微胶囊中含BCC 80～100个。

3. 实验分组：将46只PD样大鼠随机分为4组：(1)微囊化BCC移植组(微囊组)：16只大鼠，每只大鼠于右侧纹状体内植入约200个含BCC的微胶囊；(2)非微囊化BCC移植组(非囊组)：16只大鼠，每只大鼠于右侧纹状体内植入(1.8～2)×10⁴个BCC；(3)空微囊移植对照组(空囊组)：6只大鼠，每只大鼠植入约200个不含BCC的空微胶囊；(4)非移植对照组(对照组)：8只大鼠，不做脑内移植操作。

4. 移植手术：用100 g/L水合氯醛腹腔内注射麻醉大鼠(5 ml/kg)，将大鼠固定于SN-2型脑立体定位仪(Narishice, 日本)上。切开头皮及皮下组织。右侧纹状体定位：第1点：AP 0 mm，MR3.5 mm，DV5.6 mm；第2点：AP1.0 mm，MR3.0 mm，DV5.4 mm(TB-3.3 mm)。在坐标点钻开颅骨，进针至右侧纹状体，缓慢注入移植物并退针，缝合皮肤。

5. 旋转行为的观察：脑内移植术后1周开始检测阿朴吗啡(0.5 mg/kg)诱发的大鼠旋转行为，每周1次。用小动物旋转行为记录仪(中国预防医学科学院)连续记录40分钟内大鼠向健侧和患侧的旋转圈数(360度为1圈)。

6. 脑组织形态学观察：(1)HE染色：取移植区脑组织经乙醇逐级脱水，浸润液中4 ℃过夜浸润。将标本置于包埋模型中以GMA包埋，冰冻连续切片，片厚4 μm，常规HE染色。(2)SPG染色：取脑作冰冻冠状连续切片，片厚40 μm。切片入SPG液30秒，然后冷风吹，室温干燥20分钟。再将切片置于80 ℃烤箱内8分钟，然后盖上盖玻片，再放入80 ℃烤箱内1分钟，以去除自发荧光和气泡。用荧光显微镜(激发光滤片BG12，吸收光滤片GG 9/1 mm和OG 1/1 mm)在暗室内观察切片。

7. 统计学分析：实验数据用均数±标准差表示，各组内移植前、后的旋转圈数及各组间的旋转圈数用方差分析处理。

结果

一、BCC移植对PD样大鼠旋转行为的影响

移植前各组间大鼠异常旋转行为的差异均无显著性(F=1.01，P＞0.05)。在6个月观察期内，对照组8只未作移植术的大鼠其阿朴吗啡诱发的异常旋转行为无明显变化(F=0.40，P＞0.05)。空囊组的6只大鼠术后1周时其异常旋转行为似有轻度改善，但与移植前相比，差异不显著(F=1.23，P＞0.05)。非微囊组16只大鼠中9只(56.3%)移植后1周时异常旋转行为开始改善，异常旋转次数下降到移植前的44.0%～60.9%(F=6.51，P＜0.001；q检验，P＜0.01)，持续6个月；另外7只大鼠移植后无明显改善。微囊组的16只大鼠移植后1周时其异常旋转行为均明显开始改善，异常旋转次数下降到移植前的17.6%～35.6%(F=41.3，P＜0.000 1；q检验，P＜0.01)，持续10个月。结果表明，微囊化BCC移植改善PD样大鼠异常旋转行为的效果明显优于无微囊包裹的BCC移植(F=49.5，P＜0.000 1；q检验，P＜0.01)。

二、BCC脑内移植后的组织学观察

1. 非微囊组：组中旋转行为无改善的PD样大鼠，组织学检查表明其脑内无存活的BCC存在。而旋转行为得到改善的PD样大鼠，移植后6个月时，脑组织切片可