关键词： 脑/移植；免疫化学；神经通路；胚胎

【摘要】目的探讨胎脑组织移植后的存活情况及移植物与受体脑组织之间的神经纤维联系。方法以成年雄性Wistar大鼠为受体，胎龄为15～17天的Wistar胎鼠为供体。将胎鼠的脑皮层组织块移植至受体鼠的损毁脑腔内。术后应用环孢素A预防排斥反应。术后1、3、5个月处死动物，应用免疫组织化学技术(ABC法)进行脑组织切片染色，光镜及电镜下观察。结果同种胎脑皮层组织移植后存活率为30%，5-羟色胺能神经纤维从受体脑组织内长入移植物中，证明二者之间已建立神经纤维联系。结论胎脑移植物与受体脑组织之间可建立神经纤维联系。

Sereotonergic-like nerve fibers projected from the brain of adult host rat to fetal rat brain cortex graft

FU Luoan^*, YI Shengyu, WU Shenglin, et al. ^*Department of Neurosurgery, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032

【Abstract】ObjectiveTo investigate the survival of fetal rat cerebral cortex homografted to adult rat brain and neural connection between recipients brain and grafting tissue.MethodsNormal male adult Wistar rats were used as host or recipients, and the donor tissues were obtained from 15 to 17th day fetus of Wistar rats. The donor tissues were taken from the cerebral cortex of fetus and cut into pieces which were transplanted into the brain cavity previously prepared of the recipients. Transplanted rats received daily intraperitoneal injection of 10 mg/kg cyclosporin A for 2 weeks to prevent immuno-rejection. All the animals were killed at different intervals(1 to 5 months)by perfusing fixative solution transcardially. The sections of rat brain specimens were stained with ABC immunohistochemistry and examined by light and electron microscope.ResultsOnly 30% of the homografts survived and the sereotonergic-like nerve fibers were projected from host brain tissue.ConclusionThe grafted tissue of fetal brain cortex might survive and form neural connections with the cerebral cortex of recipients after homograft transplantation.

【Key words】Brain/transplantationImmunochemistryNeural pathwaysEmbryo

在胎脑组织移植的研究中，倍受关注的问题是植入的脑组织在受体体内能否长期存活，并与受体脑组织建立相应的某种神经纤维联系^［1］。本研究以大鼠作为移植受体，将胎鼠脑皮层组织作为移植物进行同种脑移植，应用免疫组织化学技术(ABC法)及电镜观察移植后的移植物存活情况，以及移植物和受体脑组织之间的神经纤维联系。

材料与方法

一、实验动物与分组

选用第四军医大学实验动物中心提供的成年雄性Wistar大鼠，体重180～320 g，随机分为移植组和对照组，各组均为22只。移植供体为胎龄15～17天的Wistar胎鼠。

二、移植手术

1. 移植物的制备：将孕鼠麻醉后在无菌条件下剖腹，快速剪开子宫壁及羊膜囊，取出胎鼠。在解剖显微镜下切取胎脑左顶区脑皮层，制备成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，作为移植物待用。

2. 受体脑创腔的制作及移植方法：受体大鼠麻醉后俯卧位固定，在严格无菌条件下行左顶部钻孔并扩大，手术显微镜下切开硬脑膜，吸除部分脑皮层组织，使之成为大小约3 mm³的创腔，彻底止血。在显微镜直视下将胎脑移植物置入到此腔内，骨蜡封闭骨窗，撒少量磺胺粉末，缝合头皮。对照组大鼠只制作创腔后关颅。

三、免疫抑制剂的使用

为预防移植后的排斥反应，我们按10mg·kg^-1.d^-1腹腔内注射环孢素A(CsA)，连用14天。

四、标本制备

两组动物在手术后的第1、3、5个月分期分批经左心室插管灌注处死，灌注液为40 g/L多聚甲醛-1 g/L戊二醛磷酸缓冲液(pH为7.4，4 ℃)，同时头部置冰块降温。经原位灌注固定后迅速开颅，取出全脑，于左顶区原手术部位取样，分别制作光镜和电镜标本。

五、ABC反应

标本经恒冷冰冻切片机切成40 μm厚，进行ABC反应^［2］。兔抗5-羟色胺(5-HT)抗体(INC，美国)和ABC(Vector, 美国)按其要求配制。切片中先滴加兔抗5-HT抗体(1∶3 000)，孵育72小时(4 ℃)，漂洗；再加用Biotin标记的羊抗兔IgG(1∶200)，作用4小时(4 ℃)后漂洗；滴加ABC(1∶100)，作用12小时(4 ℃)后漂洗；二氨基联苯胺(DAB)呈色反应，贴片，复染后光镜下观察并照相。

结果

一、移植物的存活

移植组的部分动物脑内可见存活的移植物，该组除去术后其它原因先后死亡的4只大鼠外(全身多发脓肿、腹腔内严重粘连及脑内巨大脓肿等)，移植物的存活率为6/18，于术后的1、3、5个月分别灌杀2、3、1只。对照组动物左顶区脑创腔依然存在，大小无明显改变。

二、免疫组织化学法观察

在移植物存活的脑组织切片中，移植物与受体脑组织之间的界面清晰可见。移植物中有新生血管结构，神经元胞体清晰，胞核大，着色浅，核仁深染。高倍镜下见在移植物和受体脑内均有5-HT样免疫反应阳性的神经纤维存在，呈黑色串珠状，纤维细长而迂曲，界面两侧可见到较多此类神经纤维穿越(图1)。

三、电镜观察

移植物和受体脑组织可通过增生的胶质细胞及其纤维丛为主所形成的界面来识别。在移植物中，神经元的树突上有非对称型突触形成(图2)。

图1脑皮层组织移植区中5-羟色胺样神经纤维（↑）、界面（）及神经元（△）（ABC×580）

图2移植物中的神经末梢与树突形成非对称型突触（×15 000）

讨论

有关研究表明，同种胎脑皮层组织移植后在受体脑内能够存活，且能与受体脑组织整合^［3，4］，但进行移植后因手术创伤引起的反应性胶质细胞增生所形成的疤痕，是否会阻挡移植物与受体脑组织之间建立神经纤维联系，则倍受关注。有的研究还表明，移植后存活的移植组织与受体脑组织之间没有发生神经纤维联系^［5］。本实验结果表明，移植组部分移植物存活，在植入的胎脑皮层组织中确有5-HT样神经纤维存在，电镜观察亦显示移植物中的神经元在受体脑内已建立突触联系。

在成年哺乳动物的中枢神经系统中，5-HT样神经元胞体主要位于脑干中缝核群(B 1～9群)^［6，7］，发出的投射纤维广泛分布于大脑皮层及小脑，并下行到脊髓。而胎龄小于18天的大鼠脑皮层中并无5-HT样神经纤维，此期在脑干中缝核群中的5-HT样神经元胞体才开始发育，至出生后第3～5天5-HT样神经纤维才能由中缝核群发出，投射到各相应部位^［8，9］。因此，我们认为，本实验发现的5-HT样神经纤维来源于受体脑干中缝核群，说明存活的移植物和受体脑组织之间已经建立了神经纤维联系。

本研究还发现，尽管在移植手术后使用了免疫抑制剂，但存活率只有30%，提示术后仍然存在免疫排斥反应，有关机理尚待进一步探讨。

参考文献

[1]Freed CR, Breeze RE, Rosenberg NL, et al. Survial of implanted fetal dopamine cells and neurological improvement 12 to 46 months after transplantation for Parkinson's disease. N Engl J Med, 1992, 327:1549-1555.

[2]Shu SY，Ju G, Fan LZ. The glucose oxidase-DAB-nickel method in peroxidase histochemistry of the nervous system. Neurosci Lett, 1988, 85:169-171.

[3]Palaoglu S, Benli K, Pamir N, et al. Examination of autologous and embryonic cortical brain tissue transplantation to adult brain cortex in rats. Surg Neurol, 1988, 29:183-190.

[4]Das GD, Das KG, Basko J, et al. Neural transplants: volumetric analysis of their growth and histopathological changes. Neurosci Lett, 1983, 41:73-79.

[5]任本，魏树华，冯祖荫，等. 大鼠局部脑皮层组织移植实验研究. 中华实验外科杂志，1987，4：86-87.

[6]Halaris AE, Tones BE, Moore RY. Axonal transport in sereotonin neur