关键词： T细胞；CD28；环孢素A

摘 要 T细胞需两种以上刺激信号才能充分活化。环孢素A(CsA)通过阻断CD₃活化通路而产生免疫抑制效应,本文研究CsA对CD₂₈活化通路的影响。研究发现以抗CD₃单抗和抗CD₂₈单抗共刺激后,淋巴细胞增殖比以抗CD₃单抗单独刺激时显著增强, 且对CsA不敏感, ID₅₀较单独刺激时高4~5倍。研究表明: cD₂₈通路能提供共刺激信号, 使T细胞充分活化增殖,并且这一活化通路能对CsA产生抵抗。

Effect of CsA on T cell activation CD₂₈ pathway Zhou Peijun, Tang Xiaoda, Wang Xianghui, et al. Department of urology, Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080

Abstract T cell activation CD-3 pathway can be blocked by CsA to pr

oduce immunosuppressive action. The effect of CsA on T cell activation

cD₂₈ pathway was studied. It was found that the proliferation level of lymphocytes stimulated with anti-CD-3 + anti CD-{28} mAbs was obvio

usly increased than those stimulated with anti-CD-3 mAb only, and cost

imulated lymphocytes were insensitive to CsA with a much high ID₅₀ leve

l. It was concluded that CD₂₈ could provide costimulatory signal to act

ivate T cell completely , and this pathway was resistant to CsA.

Key words T lymphocyte CD₂₈ cyclosporine A

目前器官移植临床应用的主要免疫抑制剂CsA能通过阻断钙离子依赖的CD₃活化通路,而产生免疫抑制效应^［1］。 但CsA对T细胞活化CD₂₈通路的影响及其临床意义尚在研究中。我们采用体外实验方法,初步观察了CsA对CD₂₈通路的影响。

材料与方法

一、 主要试剂: 鼠抗人CD₂₈单克隆抗体(抗CD₂₈单抗)购自Becton-Dickinson公司,鼠抗人CD₃单克隆抗体(抗CD₃单抗)购自DAKO公司, csA为Sandoz公司产品, RPMI 1640培养基购自Gibco公司。

二、 淋巴细胞分离:取健康人外周血8ml, 以肝素抗凝。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。 Hanks液洗涤两次。台盼蓝计数表明细胞存活率＞95%。

三、 淋巴细胞培养: RPMI 1640完全培养液含100g/L(V/V)加热灭活小牛血清,5万U·L^-1青霉素, 50mg5L^-1链霉素。 以96孔板培养,每孔加培养液200μl, 含细胞2×10⁵个,设三复孔。根据刺激条件不同分两组: 一组以抗CD₃单抗500μg·L^-1单独刺激;另一组以抗CD₃单抗500μg·L^-1+抗CD₂₈单抗1mg·L^-1共同刺激。

两组培养液中均设CsA浓度梯度: 0、0.1、 1、 10、 100、 1000μg·L^-1。 另设CD₂₈单独刺激组、未加任何刺激组和ConA刺激组作为对照。置37℃培养箱(含5%CO₂)培养72小时,培养终止前8小时加入1μCi［³H］标记胸腺嘧啶核苷。

四、 细胞增殖程度测定与评价:以多头细胞收集仪收集细胞。 Beckman L5800液闪仪测定同位素掺入后的cpm值。在不同的CsA浓度及相应的细胞增殖程度之间作回归分析,求出使淋巴细胞增殖抑制达50%时的CsA浓度, 即ID₅₀。 ID₅₀增高,表明对CsA敏感性降低。

结 果

一、 抗CD₂₈单抗单独刺激组、未加刺激组和ConA刺激组:以抗CD₂₈单抗单独刺激和未加刺激组, PBMC无明显增殖反应, cpm值在100以内。 ConA刺激组增殖明显, 其cpm值较抗CD₃单抗+抗CD₂₈单抗共同刺激组约高30%。

二、 抗CD₃单抗单独刺激组:淋巴细胞出现增殖反应。 不加CsA时cpm值为1 500~2 200。CsA的抑制作用呈剂量依赖性, iD₅₀为50~90μg·L^-1。

三、 抗CD₂₈单抗+抗CD₃单抗共刺激组:淋巴细胞增殖显著加强, 其cpm值较抗CD₃单抗单独刺激时约高5倍左右。 csA的抑制作用也同样呈剂量依赖性, 但其ID₅₀值比单独刺激时高4~5倍。见图1、 图2。

图1 两组cpm值变化

图2 两组细胞增殖受抑制的程度

讨 论

刺激CD₃-T细胞受体(TCR)复合物能通过磷酯酰肌醇途径,经过复杂的信号传导过程, 最终导致T细胞核内基因的活化和转录,产生细胞因子(IL-2)等, 以维持免疫细胞的克隆增殖, 此即信号1,为抗原特异性, 受主要组织相容性复合物(MHC)限制。抗CD₃单抗与CD₃分子结合,能产生该活化信号1。 抗CD₂₈单抗能模拟B₇分子的作用,与CD₂₈分子结合, 产生共刺激信号2, 信号2的产生无抗原特异性,不受MHC限制。

B₇: CD₂₈/CTLA-4分子同属于Ig超基因族,其基因具有高度同源性。 CD₂₈是一种分子量为44kD的糖蛋白,在T细胞表面以单体或同源二聚体的形式表达,膜外部分由二硫键构成Ig-V区样的折迭, 可以与配体相结合。外周血中80%的T细胞表达CD₂₈分子。 CTLA-4的结构与CD₂₈高度相似。 b₇也是一种跨膜糖蛋白, 根据不同实验室克隆B₇分子的差异,将其分为B₇-1(CD₈₀)、 B₇-2(CD₈₆)和B₇-3^［2］。

刺激CD₂₈分子产生的共刺激信号2,在T细胞活化增殖以及产生效应的过程中,均起十分重要的作用。 深入研究CsA等免疫抑制剂对该活化通路的影响,有利于指导临床用药。我们实验结果表明, 由抗CD₃单抗单独刺激产生的信号1单独作用,淋巴细胞并未充分活化增殖, 且能被低浓度的CsA阻断;若同时由抗CD₂₈单抗提供共刺激信号2,则可使淋巴细胞增殖显著加强, 且对CsA不敏感, 产生明显抵抗,其ID₅₀比单独刺激时成倍增加。抗CD₂₈单抗单独刺激无效,不出现增殖反应。

CD₂₈分子产生共刺激信号的机理尚未完全阐明,但与CD₃-TCR的信号产生和传导过程截然不同。有研究表明, 刺激CD₂₈可以在基因转录前和转录后两个水平,增加细胞因子的产生: (1)T细胞通过TCR与抗原提呈细胞(APCs)交联后,引起TCR和CD₂₈寡聚体化, 由CD₃-TCR传导信号1后启动细胞因子基因;(2)在IL-2基因增强因子的-164~-154位置存在CD₂₈反应元件(CD₂₈Response elements, CD₂₈RE)^［3］, 刺激CD₂₈可以增加IL-2增强子的活性,使mRNA转录增加;(3)多种细胞因子mRNA的3′端非编码区存在的(AUUUA)3重复序列极易被降解^［4］, cD₂₈能通过某种机制稳定mRNA,增加细胞因子的产生。抗CD₂₈单抗和抗CD₃单抗共刺激后淋巴细胞增殖明显增强,是因为CD₂₈共刺激能增加CD₃-TCR启动后各种细胞因子(尤其是IL-2)的产生,并使T细胞由低细胞因子分泌量的自分泌转到高细胞因子分泌量的旁分泌形式。共刺激后淋巴细胞的增殖对CsA产生抵抗, iD₅₀增高, 表明CsA不能阻断T细胞活化CD₂₈通路。 csA能阻断CD₃-TCR介导的Ca²⁺依赖的信号传导通路^［1］。 cD₂₈分子产生和传导共刺激信号的过程中, 不依赖Ca²⁺浓度变化,故能抵抗CsA的作用。 这是目前唯一已知的对CsA不敏感的T细胞活化通路,这一活化通路的存在不容忽视, 需采用其它方法加以阻断,而且阻断共刺激信号的产生,可以诱导供者特异性免疫无反应状态^［5］。器官移植后细胞因子表型由TH₁向TH₂转变^［6］、间接性抗原提呈、 csA个体敏感性差异的产生、以及慢性排斥反应的发生^［7］等过程,都涉及这一活化通路。 体内的免疫反应高度复杂, CD₃-TCR这一主要的T细胞活化通路仍需由CsA加以阻断。我们研究证实, cD₂₈产生共刺激信号, 能显著增强淋巴细胞的增殖反应,且对CsA产生抵抗。 深入研究T细胞活化CD₂₈通路,对指导免疫抑制剂的合理应用及免疫耐受的诱导均有十分重要的意义。