随着透析事业的发展，慢性肾功能衰竭患者的存活率和生存时间明显提高，而继发性甲状旁腺功能亢进（secondaryhyperparathyroidismSHPT）作为慢性肾衰的长期并发症，其发病率也逐渐增高，常严重影响患者的生活质量，甚至导致其死亡^［1］。由于甲状旁腺激素（parathyroidhormone，PTH）过度分泌而引起的内环境紊乱是肾性甲状旁腺功能亢进（uremichyperparathyroidism）发生、发展的中心环节。研究此类患者培养的甲状旁腺细胞分泌PTH的变化，可帮助我们更深入地了解肾性甲旁亢的发病机制，并为其治疗研究提供科学的依据。但限于取材困难等原因，国内尚无单位开展此方面的探索，国际上也只有少数实验室进行甲状旁腺的细胞培养。本实验中，我们在国内首次成功培养了肾性甲旁亢患者的甲状旁腺细胞，并观察其PTH分泌的变化，为进一步开展肾性甲旁亢的研究奠定了基础。

1材料和方法

1．1组织来源甲状旁腺组织取自接受甲状旁腺全切加前臂移植术^［2］的肾性甲旁亢患者，女性，51岁。尿毒症血透6年，血清全段PTH（intactPTH，iPTH）为2000 ng／L(正常，10～70ng／L)，碱性磷酸酶（ALP）300U／L（正常 52～90U／L），血Ca 3.0mmol／L，已排除铝中毒骨病，结合甲状旁腺放射性核素断层扫描（ECT）及B超检查确诊为“慢性肾衰继发性甲状旁腺功能亢进”。手术切除的甲状旁腺分别为0.8g，6.4g及8.6g，组织内部见较多出血、坏死及钙化。术中冰冻切片的病理结果为“甲状旁腺增生及腺瘤”。

1．2甲状旁腺组织的细胞培养参考LeBoff的实验方法^［3］。

手术获得的甲状旁腺组织立即放入4℃的Eagle液中，尽快培养。剪去结缔组织和脂肪组织，去除坏死及钙化的部分，挤压出组织间隙的红细胞。剪成1～2 mm³大小的碎片后，用含0.2％胶原酶Ⅰ的消化液37℃水浴消化约1 h，每隔10 min摇动一次。2000 r／min离心5 min，弃上清，用吸管反复吹打沉淀，促使细胞进一步分散，制成细胞悬液后经200 μm网筛过滤，再次离心，重复3次以去除成纤维细胞、脂肪细胞、红细胞等。将细胞制成悬液，台盼兰染色计数，细胞成活率＞90％，其中30％～40％是单个甲状旁腺细胞，余为2～10个细胞组成的细胞小簇。

细胞培养液用DMEM-HF₁₂，含15%灭活小牛血清、15 mmol／LHepes、青、链霉素、5mg／L胰岛素，pH7.4，经测定钙离子浓度为1.05mmol／L，镁离子浓度为0.70 mmol／L。将细胞悬液加入24孔培养板中，细胞浓度为2.5×10⁵个／cm²，置37℃5％CO₂培养箱孵育，每48 h换液一次。分别于培养30、60、90、120、150和180min及24、48、72、96、120h收集上清液，每个时相的标本均取自3个不同的培养孔。上清液保存在－20℃，待测iPTH。

1．3培养液上清iPTH的测定用¹²⁵I放免法检测，复孔测定。药盒购自BioSourceEuropeS．A．公司，按其说明书严格操作。

吸取300 μl稀释的上清液、标准及质控加入相应的包被管。每管加100 μl温育缓冲液，室温下振荡1 h。弃去所有试管的液体，洗涤液洗2次。每管加100 μl标记液，室温下振荡1 h。弃去所有试管的液体，洗涤液洗2次。γ计数器计数。

1．4统计方法所有数据用均数±标准差（±s）表示，用回归分析两组资料间的相互关系，P＜0.05认为有统计学差异。

2结果

2．1细胞的形态特点在培养初期，甲状旁腺细胞有较明显的聚集性，24h后开始贴壁，4～5天长成单层。细胞直径约为10～20μm，呈多角形或星形，核圆，居中，呈现上皮细胞的形态特征，胞浆内常可见分泌颗粒(见图1)。

图1培养的甲状旁腺细胞（×400倍）

2．2细胞iPTH的分泌在培养后的3h，甲状旁腺细胞iPTH的分泌量逐渐增加，并与培养的时间呈显著正相关（r＝0.97，P＜0.01），见图2。

图2培养3小时内甲状旁腺细胞iPTH分泌的变化

在培养3 h以内，随着时间的推移，单位时间内iPTH的分泌量逐渐下降，见图3。

在培养48 h内，甲状旁腺细胞iPTH的分泌仍呈上升趋势，但上升幅度减慢，见图4。

图3不同时间段内iPTH分泌量的变化

图448小时内甲状旁腺细胞iPTH的分泌

3讨论

正常情况下，细胞外Ca^2＋浓度是调节PTH分泌的主要因素。慢性肾衰继发甲旁亢时，甲状旁腺细胞过度分泌PTH，但PTH的分泌量仍与胞外Ca^2＋浓度有关^［4］。一般认为，当胞外Ca^2＋浓度为1mmol／L时，甲状旁腺细胞自身的性质最稳定，因此本研究选择DMEM-HF₁₂作为营养液，其钙离子终浓度为1.05 mmol／L。另外，Mg^2＋浓度也是影响PTH分泌的重要因素，其效力约为Ca^2＋的一半，本实验中Mg^2＋的终浓度为0.70 mmol／L。

实验结果表明，消化后的甲状旁腺细胞能立即分泌PTH，在培养的前3 h内，PTH呈线性分泌，说明细胞保持良好的活性；但分泌的速度随时间的延长有所下降，考虑可能与下列因素有关：①随着胞外PTH浓度的增高，甲状旁腺细胞通过自身的调节作用，分泌的PTH量逐渐减少，以保持胞内外PTH浓度的平衡，②随着培养时间的延长，甲状旁腺细胞自身的性质逐渐发生改变。

本研究还显示，在培养48 h以内，PTH的分泌量仍呈上升趋势，可达10ng／10⁵细胞。由于甲状旁腺细胞有明显的聚集性，本实验中有较多的细胞没有贴壁，换液后导致未贴壁的细胞大量丢失。我们还发现，在培养48 h后到第二次换液之间，培养液上清中PTH的测定值随时间的延长逐渐下降，由于此阶段培养孔中细胞的数目会逐渐增加，因此提示甲状旁腺细胞的活性可能开始下降。另外，Mithal等^［5］在研究培养的牛甲状旁腺细胞时也发现，随着时间的延长，甲状旁腺细胞对胞外Ca^2＋的反应性降低，他认为这与细胞的钙敏感受体（calciumsensingreceptor）表达下降有关。而钙敏感受体是影响PTH分泌及甲状旁腺细胞活性的重要因素^［6］。

综上所述，用本实验方法能成功地培养出人甲状旁腺细胞，在培养初期细胞保持良好的活性，但数天后PTH的分泌能力开始下降。因此，如果以甲状旁腺细胞作为研究对象，为了保证实验结果的可靠性，最好选用培养早期的细胞。

本课题为江苏省科委中日友好国际合作资助项目(基金编号：182DE9902)

参考文献

1，王笑云，王宁宁．慢性肾衰继发性甲旁亢的诊治．医师进修杂志，1999，22（9）：7

2，王笑云，吴宏飞，胡建明等．甲状旁腺全切加前臂移植术治疗继发性甲状旁腺功能亢进．中华医学杂志，1997，77（11）：873

3，LeBoff MS，Shoback D，Brown EM et al．Regulation of parathyroid hormone release and cytosolic calcium by extracellular calcium in dispersed and cultured bovine and pathological human parathyroid cells．J Clin Invest，1985，75：49

4，Brown EM．Physiology and pathophysiology of the extracellular calcium-sensing receptor．Am J Med，1999，106：238

5，Mithal A，Kifor O，Kifor I et al．The reduced responsiveness of cultured bovine parathyroid cells to extracellular Ca^2＋ is associated with marked reduction in the expression of extracellular Ca^2＋sensing receptor messenger ribonucleic acid and protein．Endocrinology，1995，136：3087

6，王宁宁．甲状旁腺钙受体与肾性甲旁亢关系的研究进展．国外医学内分泌学分册，2000，20（1）：26

（2000－02－12收稿，2000－03－06修回）