摘要目的：探讨人血T细胞在异种肾移植（猪→人）间接体内模型中的变化。方法：以模拟人体生理条件下的体外灌注系统，将人新鲜血灌注离体猪肾25只(实验组)，人肾12只(对照组)；利用流式细胞术，检测灌注前后不同时间内人血T细胞的变化。结果：经猪肾灌注的人血T细胞在灌注一开始即锐减，由灌注前的67.8±3.4下降至32.4±2.1，下降了约52％；随着灌注时间的延长，其减少的幅度逐渐减弱。而对照组T细胞在灌注前后无明显变化。结论：与同种移植不同，异种器官接通血流一开始，人血T细胞锐减，表明T细胞可能通过与猪肾血管内皮细胞的粘附，参与了异种移植排斥反应。

CHANGES OF T CELLS IN EX VIVO STUDY OF PIG-TO-MAN RENAL XENOTRANSPLANTATION

Wang Xi，Min Zhilian，Zhu Youhua，Qi Jun

Urological Center of PLA，Changzheng Hospital，Second Military Medical University of PLA，Shanghai 200003

OBJECTIVE To investigate the changes of T cell and in an ex vivo study of pig-to-man renal xenotransplantation．

METHODOLOGY Twenty-five pig kidneys and 12 human kidneys（as control）were perfused with human fresh blood in an ex vivo model of pig-to-man renal xenotransplantation．T cells labeled with immunofluorescent McAbs were analyzed by flow cytometer before and after perfusion．

RESULTS In the first minute of xenogenic perfusion，human T cells decreased 52％（from 67.8±3.4 to 32.4±2.1），and the magnitude of T cell decrease lessened there after．No significant change was observed in control group before and after perfusion．

CONCLUSION In this study，it is found that human T cells may play a role in the cell-mediated xenogeneic rejection of pig-to-man renal xenotransplantation possibly by adhering to procine renal endothelial cells during the perfusion．

Key words xenotransplantation kidney T cell

异种器官移植是缓解可供移植的人类器官日益短缺矛盾的有效手段，但仍需克服许多障碍。异种移植物接通血流后面对的是受者的整个免疫系统，不能排除细胞免疫的作用，为此，我们利用已经建立的异种（猪→人）肾移植间接体内模型^［1］，用流式细胞术检测了人血T细胞流经猪肾前后的变化。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验组猪肾25只，取自5～6月龄猪(购自上海郊县)。取肾修肾、灌洗同文献［1］。肾重53.7±6.4g，热缺血时间7.1±3.3min；冷缺血时间21.8±2.4h；温缺血时间30.6±8.3min。

1.1.2对照组人肾12只，A型3只，B型5只，O型4只。取肾修肾、灌洗同文献［1］。肾重122.7±8.8g。热缺血时间6.7±1.7min；温缺血时间60.8±8.6min；冷缺血时间37.7±7.2h。

1.1.3人血液取自健康成人静脉，取血前二周内未服用药物，每单位血液200ml，肝素抗凝（50U／ml）。取出后立即施行灌注，单次灌注200ml，非循环。血液取出至灌注开始时间为9.7±6.1min。

1.1.4试剂样本处理液：（A：红细胞溶解剂；B：白细胞稳定剂；C：细胞膜固定剂)；抗CD3：UCHT1IgG1（小鼠）异硫氰酸荧光素（FITC）标记；抗CD16：3G8IgG1(小鼠)藻红蛋白（PE）标记。以上试剂购自法国IMMUNOTECH公司。HCA离体肾保存液(上海中心血站)。

1.1.5仪器电热恒温水温箱（HHW21Cr600，北京长安科学仪器厂）；医用滚柱泵（MGS-02，上海医疗器械研究所）；中空纤维氧合器（3381Medtronic，Inc，USA）；输血器（上海市中心血站）；流式细胞仪（EPICSXL，Coulter，USA）；样本处理机（Q-PREP，Coulter，USA）。

1.2方法

1.2.1灌注方法同文献［1］

1.2.2血液样品制备及标记人全血经复温至37℃，氧饱和后由肾动脉灌入，在灌注前及灌注后1，3，5，7，10，15，30min时，由肾静脉各取血液2ml待检。用微量取样器取样本100μl放入12×75mm试管中。在装有样本的12×75mm试管中加入抗CD3单抗及抗CD16单抗各20μl直接标记。室温下静置15min。经样本处理机加红细胞溶解液600μl，充分振荡，使红细胞溶解；加白细胞稳定液250μl，细胞膜固定液50μl，准备上机分析。

1.2.3流式细胞术分析细胞悬液样本经45μm尼龙膜滤入检测管。选用空气冷却氩离子激光管，激发波长488nm，功率250mW。测定前，用荧光小球（beads）校正仪器至前向散光和绿色荧光的CV%均在2%以下。冲洗样本管道后，输入样品，待测样品在气体压力下进入流动室，流动室内充满鞘液，鞘液用以裹携细胞。调节样品液与鞘液之间压力差为5～10Psi，使细胞样品液以稳定的层流通过检测喷嘴，由流动室喷嘴流出时形成单一的细胞液柱，液柱与高度聚焦的激光束垂直交汇。相交点即测量区。经过测量区的细胞被激发产生荧光。通过与入射光和液柱垂直方向的检测器、透镜、光阑、滤片等接收每个细胞与激光相遇后产生的荧光。(每份样本计数5 000个细胞)讯号输入计算机，经计算机处理得出各组分阳性细胞的百分率及总计细胞数。

2结果

CD3^＋CD16^-T细胞计数见附图：以时间为横坐标，CD3^＋CD16^-T细胞所占白细胞总数的百分率为纵坐标绘图。可见：经由猪肾（图中虚线）灌注的人血液中的CD3^＋CD16^-T细胞在灌注开始时即锐减，由灌注前的67.8±3.4下降至32.4±2.1，下降了约52％；随着灌注时间的延长，其减少的趋势逐渐减弱，曲线呈饱和形式。而经由人肾(图中实线)的人血中CD3^＋CD16^-T细胞灌注后各时间段与灌注前相比无明显变化。

附图CD3^＋CD16^-T细胞计数的变化

3讨论

异种器官移植中，对细胞免疫作用的了解远不及对体液免疫的作用了解得多。细胞免疫对异种移植物的破坏作用是肯定的^［2］。但对其确切的机制知道得极少。在猪→人异种器官移植超急排斥反应中，主要为人血中天然抗体识别猪血管内皮细胞表面的糖蛋白或糖脂末端的α半乳糖残基并激活补体所致的移植物的不可逆损害^［3～6］。一旦猪→人间异种移植超急排斥反应被克服，摆在人们面前的将是细胞免疫所带来的困扰，这是无法绕开和回避的重大课题。

CD3分子在正常人外周血中表达于成熟T淋巴细胞和一些自然杀伤细胞，不表达于外周血B细胞、单核细胞、粒细胞和血小板，是鉴定T细胞的重要标记。CD16抗原是NK细胞表面的一种低亲和力的IgGFc受体，是常被用来识别和检测NK细胞的特异标志。

为了能够对细胞免疫在异种器官移植排斥反应中的作用有所认识。我们以CD抗原为监测指标，利用模拟人体生理条件下的体外灌注系统，用人新鲜血灌注离体猪肾、人肾，并观察灌注前后血中CD3^＋CD16^－T细胞的变化。结果表明：T细胞在流经猪肾时大量减少，特别是灌注一开始，减少得尤为剧烈。作为T细胞分型标志的表面分子CD3的减少可能有以下几种情况：①T细胞表面CD3分子丢失；②T细胞表面CD3分子被猪肾所分泌的相应配体所封闭；③T细胞与猪肾血管内皮细胞发生粘附。

我们未发现丢失CD分子的证据，从血液的抽取到灌注开始，CD分子的测定值均较恒定。由对照组可知，本灌注系统不会导致CD3分子的丢失。为了清除猪肾血管内可能存在的CD分子的相应配体和可能使CD分子丢失的物质，我们在人血灌注开始前曾用0～4℃的生理盐水先灌注猪肾2～5min，再通入人血，CD分子减少的程度和趋势依然不变。最有可能的就是T细胞与猪血管内皮细胞发生粘附。随着灌注时间的延长，猪肾血管内皮细胞表面被T细胞识别并结合的位点不断被占据，人血中T细胞减少的幅度亦逐渐减弱，逐渐趋向灌注前的水平，如附图曲线所呈现的形态。这与文献报道一致^［7］。至于是否由于猪肾血管内皮细胞在通入人血后分泌或释放某种新的介质封闭了CD分子，未见报道，这也是我们今后准备进行的工作。

已有的研究结果提示：无论在concordant还是在discordant的异种移植实验中，细胞免疫在异种排斥反应中可能以某种机制识别异种抗原并在异种排斥反应中发挥一定的作用^［8，9］。人类的淋巴细胞受体可识别猪的白细胞抗原（SLA）Ⅱ类分子^{［10，11］}，用人淋巴细胞悬液灌注离体大鼠心脏时，T细胞有显著沉积^［12］。间接证据也显示：应用抗淋巴细胞抗体后，异种移植物的存活时间明显延长^{［13～15］}。

本实验条件下，与对照组相比，T细胞在与猪肾血管内皮细胞接触的早期即发生如此迅速且幅