【摘要】目的探讨mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失与老年聋的关系。方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)及套式PCR技术，扩增正常及缺失区mtDNA片段，pGEM-T Easy载体连接扩增产物，重组、克隆目的DNA进行序列分析。检测67耳（41例）颞骨切片、21例蜗核（双侧）、20例颞叶脑组织、20例心肌和22例肝脏组织中mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失的发生率，根据患者生前的临床资料分为老年组与非老年组、老年聋组与老年听力正常组进行比较分析。结果被检所有标本均成功扩增到正常mtDNA编码tRNA和ND1片段的NADH基因。在老年人多种组织中检测到了mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失，老年组不同器官组织中mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失发生率均明显高于非老年组，两组之间的差异具有显著性意义（χ²检验，P＜0.05）。老年聋患者颞骨切片和蜗核组织中mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失的发生率明显高于老年听力正常组，其差异具有显著性意义（χ²检验，P＜0.05）；而与听觉无关的心肌和肝脏组织中mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失发生率在两组之间差异无显著性。结论 mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失的发生与老化有关；内耳和蜗核组织中mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失与老年聋的发生有关。

Mitochondrial DNA⁴⁹⁷⁷ deletions associated with human presbycusis

HAN Weiju, HAN Dongyi, JIANG Sichang, et al.

(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)

【Abstract】Objective To determine whether or not the mtDNA⁴⁹⁷⁷ deletions contribute to human aging and involve in the development of presbycusis. Methods 67 sides of archival temporal bone sections, 20 temporal brains, 21 cochlear nucleus, 20 hearts and 22 livers were harvested and the total DNA was extracted. The presence of mtDNA⁴⁹⁷⁷ deletions was examined using nest polymerase chain reaction（PCR）. ResultsOur results showed: (1) the highly conserved mitochondrially-encoded tRNA and ND1 segments were amplified from all tissues, as well as mtDNA⁴⁹⁷⁷ deletions related to aging. (2) The incidence of carrying mtDNA⁴⁹⁷⁷ deletions in all tissues in aged group was significant higher than that of young control group (P＜0.05). (3) The incidence of carrying mtDNA⁴⁹⁷⁷ deletions in temporal bone sections and cochlear nucleus with presbycusis patients was significant higher than that of aged normal hearing control group (P＜0.05). However, the incidence of carrying mtDNA⁴⁹⁷⁷ deletions in heart and liver were no significant difference between presbycusis patients and the control group. ConclusionThese findings indicated that mtDNA⁴⁹⁷⁷deletions in human contribute to presbycusis, as well as aging.

【Key words】DNA，mitochondria； Presbycusis； Aged； Temporal bone； Cochlear nucleus； Polymerase chain reaction

近年来的研究显示，mtDNA缺失引起的氧化磷酸化水平下降在衰老过程中起着重要作用^［1，2］，但内耳和蜗核等听觉器官中mtDNA缺失是否与老年聋有关，还不很清楚。本研究利用套式聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)等分子生物学技术，检测老年人、老年聋及对照人群不同组织中mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失，探讨mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失与老年聋的关系。

材料与方法

一、标本来源

颞骨切片均取自解放军耳鼻咽喉科研究所颞骨库，为保存14～20 年的火棉胶切片。大脑、蜗核、心肌和肝脏组织取自解放军总医院病理科保存的甲醛固定标本。选取病例资料完整、有听力检查结果、无耳毒性药物应用史及噪声接触史、保存完好的上述组织标本用于实验。显微镜下根据解剖位置^［3］分离双侧蜗核组织。取颞叶脑组织、心肌、肝脏和颞肌各约1 g分别用于DNA提取。

二、临床资料及分组

共选取67耳（41例）颞骨切片、21例蜗核(双侧合用于DNA提取)、20例颞叶脑组织、20例心肌、22例肝脏组织用作实验。实验所选蜗核、脑、心肌和肝脏组织均为临床资料完整、颞骨切片保留完好的病例，同一患者的上述组织同时用于实验，但由于标本保留不全，部分病例仅有颞骨切片，而其它组织标本缺如，故颞骨切片例数多于组织标本数。依据所检病例的临床资料和年龄分组。首先按年龄大小分组，老年组：年龄大于或等于60岁，共19例（38耳），平均66.7岁；非老年组：50～59岁8例（14耳），50岁以下14例（15耳），共22例（29耳）。

按是否存在老年聋分组，老年聋组包括老年前期患者（50～59岁）4例（8耳），均为男性；老年期（60～84岁）13例26耳，男12例，女1例，全组平均年龄67.9岁。耳聋组17例(34耳)中均有双耳听力进行性减退史，病程中无耳毒性药物史及声损伤史，纯音测听（最后1次听力检查时间距死前7个月～6年）示双侧感音神经性聋，其中高频陡降型12耳，斜坡型15耳，平坦型7耳。老年听力正常对照组：选择平素身体健康，生前无听力下降史者作对照，其中老年期（60～84岁）10例（13耳），老年前期（50～59岁）4例（6耳），共14例19耳，平均年龄63.8岁。

三、组织DNA提取

取经过耳蜗中轴，包含Corti器、螺旋神经节、囊斑、Scarpa神经节的未染色颞骨切片2～4张，脱去火棉胶；取甲醛固定的颞叶脑组织、蜗核、心肌和肝脏组织冲洗去固定液；分别剪碎；加入适量消化缓冲液［100 mmol/L NaCl，10mmol /L Tris，pH 8.0，0.5% 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，25 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(ethylene diaminetetraacecetic acid，EDTA )］和蛋白酶K，振摇混匀，55℃水浴，消化24 h；加入等体积平衡酚和氯仿/异戊醇抽提2次；加 2倍体积无水乙醇、1/10体积乙酸钠混匀，置-20℃过夜，离心（-4℃，14 000 r/min，30 min）沉淀核酸，70%预冷酒精脱盐，适量Tris-EDTA缓冲液(TE) 溶解核酸沉淀作为PCR模板，-20℃保存备用。

四、PCR扩增

根据Nature发表的mtDNA全序列^［4］，按寡核苷酸引物设计原则设计3对PCR扩增引物，由上海生工公司合成，其碱基序列在mtDNA基因组的位置如下： P3 nt3153～3172，P4 nt3551～3531；P11 nt8292～8312，P12 nt13584～13564；P13 nt8406～8425，P14 nt13525～13506，计算机检索这样组合的3对引物/无引物二聚体及发夹结构形成。

引物对P3、4可以扩增编码正常mtDNA tRNA和ND1片段的NADH基因，长度为399 bp。P11、12及P13，14两对引物可以组合起来，用于套式PCR检测mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失的存在；对于正常的mtDNA，因较短的延伸时间不足以合成大于5 kb的片段，此套式PCR将无阳性产物；若mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失存在，P11、12可扩增到316 bp片段，P13、14位于P11、12的内侧，可扩增144 bp片段。如果以P11、12的扩增产物为模板，以P13、14为引物再行PCR扩增，即套式PCR，也可扩增到144 bp的产物，但其敏感性就大大提高了，可以检出极微量的mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失。

PCR反应体系包括模板100～200 ng，10×dNTP 5 μL，10×Buffer 5μL，引物各0.4 μmol/L，加三蒸水至50μL，Mg²⁺终浓度为1.5 mmol/L，97℃预变性5 min，冰浴冷却，加Taq酶2U，置 PCR仪扩增，扩增条件：变性95℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共35循环，后延伸7 min。

五、 扩增产物鉴定

PCR产物在含有0.5 mg/L 溴化乙锭 (ethidium biomide，EB)的1.2～1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳；在254 nm紫外线灯下观察橙红色荧光带。再将PCR产物以低熔点琼脂糖电泳法纯化，将纯化的PCR片段以T4 DNA连接酶与 pGEM-T Easy载体（Promega，美国）连接；转化至感受态大肠杆菌JM109（华美生物工程公司），于37℃缓缓振摇1 h(75 r/min)，取50～200 μL转化菌均匀涂布在含有50 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml X-Gal和0.5 mmol/L 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (isopiopylthio-β-D-galactoside，IPTG)的Luria-Bertain(LB)培养基琼脂平板上，37℃倒置培养12～16 h。用灭菌牙签挑取琼脂平板上的白色菌落，移入5 ml LB培养基（含50 μg/ml氨苄青霉素）中，振摇过夜。用小量质粒提取试剂盒（Promega，美国）提取质粒，以EcoR I酶切证明存在正确的插入片段。送中国科学院微生物研究所进行全自动测序。

六、统计学处理

用SAS软件进行统计学处理，比较两组之间mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失的发生率用χ²检验。

结果

一、编码tRNA和ND1片段的正常mtDNA扩增

从颞骨切片、脑组织、蜗核、心肌和肝脏组织提取的DNA模板，以引物P3、P4扩增均可获得编码正常mtDNA tRNA和ND1片段的NADH基因，长度为399 bp（3153～3551）；并经测序证实扩增产物与mtDNA剑桥序列一致^［4］，证明mtDNA提取方法