【摘要】目的以原发性鼻咽癌为研究对象，探讨p16抑癌基因，myc家族癌基因在鼻咽癌发生、发展及其生物学行为的变化规律。方法用多重聚合酶链反应(multiple polymerase chain reaction, MPCR)、限制性内切酶PCR、免疫组化及逆转录PCR(reverse transcriptase PCR, RT PCR)方法，检测69例鼻咽癌活检肿瘤组织中，P16基因纯合缺失、甲基化、p16基因蛋白表达(免疫组化)、c-myc基因表达等情况。结果P16基因纯合缺失7例，甲基化11例，总失活率为26.1%(18/69)。免疫组化检测p16基因蛋白表达阴性60.9%(42/69)；阳性39.1%(27/69)。RT PCR，myc基因检测表达结果73.9%(51/69)，无表达者26.1% (18/69)。结论研究表明鼻咽癌发生与p16抑癌基因失活、癌基因激活有着密切关系。

Studies on c-myc gene expression and p16 gene inactivation in nasopharyngeal carcinoma

ZHENG Jun, LI Wensheng, HUANG Ruokui, et al.

(Department of Head and Neck Surgery，Tumor Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510095, China)

【Abstract】ObjectiveThe alterations of c-myc and p16 genes and their relationship with the development and progression of nasopharyngeal carcinoma were studied. Methods Sixty-nine biopsies of nasopharyngeal carcinoma were examined for the homozygous deletion methylation and reduced expression of p16, and the overexpression of myc family oncogenes using multiple PCR, restriction endonuclease coupled PCR, reverse transcriptase PCR and immunohistochemistry. ResultsThe homozygous deletion and methylation of p16 gene were found in 7 and 11 cases respectively. The total inactivation rate was 26.1% (18/69). The negative expression of p16, as shown by immunohistochemical examination was found in 42 out of 69 cases (60.9%). The overexpression of myc family oncogenes was found in 51 cases (73.9%). ConclusionIt suggests that the inactivation of anti-oncogene p16 and the activation of myc family oncogene may play an important role in the development of nasopharyngeal carcinoma.

【Key words】Nasopharyngeal neoplasms; Genes, myc; Genes, p16; Inactivated

肿瘤的发生是多种因素共同作用的结果，其中部分肿瘤是由于原癌基因的激活和/或抑癌基因失活而发生的。随着分子生物学技术的发展，癌基因和抑癌基因与多种肿瘤相关性的研究日益增多。本研究以鼻咽癌肿瘤活检组织为研究样本，采用多重聚合酶链反应(multiple polymerase chain reaction, MPCR）、限制性内切酶PCR、逆转录PCR(reverse transcriptase PCR, RT PCR)等方法，研究p16抑癌基因失活情况，癌基因表达，探讨鼻咽癌发生、发展及其生物学行为与上述两类基因的关系，试图建立基因诊断新方法，为临床诊断，预后判断、指导治疗提供科学依据。

材料与方法

一、材料

1．样本：取自1995年1月～1997年1月广东省粤北人民医院耳鼻咽喉科患者，经病理证实为鼻咽癌69例，其中13例复发后取材。患者男45例,女24例，年龄最小21岁，最大69岁。免疫组化方法的喉癌对照组69例由天津耳鼻咽喉科研究所提供，活检标本取后-80℃保存。

2．试剂：引物：myc基因通用引物序列： 上游 5′-CCC AGC GAG GAC ATC TGG AAG AA-3′， 下游 5′-GAG AAG CCG CTC CAC ATG CAG TC-3′。

β2-MG珠蛋白引物序列（对照）： 上游 5′-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3′， 下游 5′-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3′， 由中国医科院肿瘤研究所遗传室李申德教授提供。

p16基因引物序列： 外显子1 5′-GAA GAA AGA GGA GGG GCT G-3′， 5′-GCG CTA CCT GAT TCC AAT TC-3′， 外显子2 5′-GGA AAT TGG AAA CTG GAA GC-3′， 5′-TCA TCA GTC CTC ACC TGA G-3′， 根据文献［1］设计，中科院微生物所合成。

内对照引物(β-珠蛋白)： 5′-GGT AAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAG ACA GGT ACG GCT CTC ATC-3′， 5′-CCC TTC CTA TGA CAT GAA C-3′，由美国赛百盛公司合成。

其他试剂：Taq耐热聚合酶、dNTP、蛋白酶K、Smal内切酶等均购自北京通康公司。免疫组化p16蛋白试剂盒：由美国Maxin公司生产，购自福州迈新生物公司。RT PCR盒：购自北京鼎国生物公司。其他试剂：由北京红十字朝阳医院基础医学研究中心提供。

3.仪器：PE-480扩增仪、低温离心机、UVP凝胶成像仪等均由北京红十字朝阳医院提供使用。

二、方法

1．免疫组织化学方法：活检组织经石蜡包埋后，连续切片4 μm厚，常规脱蜡、水化、3% H₂O₂室温20 min、蒸馏水洗3次，TBS洗3次，用羊血清封闭15 min(1∶20)，然后P16工作液4℃过夜，次日TBS洗3次，a Rb IgG/Bio 1:200室温1 h，TBS再洗3次，DAB镜下控染，自来水充分冲洗；苏木素复染、分化、透明、封固。结果判定：观察10个高倍视野1 000个肿瘤细胞，RC细胞核出现棕黄色颗粒或均匀棕黄色为阳性，记录方式：(-)无明显阳性细胞；(+)阳性细胞＜40%；(++)阳性细胞数＞40%^［2］ （图1，2）。

2．p16基因失活的检测： 纯合缺失检测采用常规方法提取组织DNA，首先将肿瘤标本(新鲜)约100 mg置于500 μL 赖胺酸缓冲裂解液中，充分捣碎后加蛋白酶K 500 μg/ml，室温放置24 h，然后酚、氯仿、氯仿/异戊醇(24∶1)抽提，无水乙醇沉淀DNA，-20℃过夜，次日用80%乙醇清洗1次，干燥，加TE液80 μL。RNase酶1 μL (10 mg/ml) 37℃水浴30 min后，冷却，4℃溶解24～48 h，扩增用或-20℃冰箱冻存待用。用PCR方法扩增p16基因第一外显子和第二外显子及内对照引物的多重PCR扩增。反应体积20 μL：模板DNA 1 μL、10×buffer液2 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、DMSD 1 μL、外显子1引物2 μL，如外显子2及内对照引物各1 μL。然后补足水于20 μL。PCR扩增条件：94℃变性5 min，72℃加入Taq耐热聚合酶1单位，进入循环，循环参数为94℃变性1 min、60℃退火1 min、72℃延伸1 min，35个循环后72℃再延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳：取10 μL扩增产物，2 μL电泳buffer液，混匀后点于2%琼脂糖凝胶孔中，电压100 V，时间20～25 min后，EB染色，在紫外UVP凝胶成像仪下分析结果(图3,4)。

甲基化检测采用对未发现纯合缺失标本进行p16基因异常甲基化检测。取肿瘤组织DNA 1 μg(约3 μL)，用甲基化敏感限制性内切酶Sma1消化25℃过夜。总体液量10 μL，用上述方法分别扩增p16基因外显子1和内对照，如果经Sma1消化的DNA仍能扩增出外显子1则判断为甲基化, 即该基因外显子1的5′端上游出现异常甲基化(图5)。内对照引物序列不含有内切酶位点，所以不能被SmaI消化，每份标本必有内对照带扩出。

图3p16基因外显子1纯合缺失。泳道1：DNA分子量标志X174/Hae Ⅲ；泳道2：p16外显子1阳性标准；泳道3～10：肿瘤组织标本，其中泳道4为p16外显子1纯合缺失

图4p16基因外显子2纯合缺失。M：核酸分子量标志pBR322/MSP I；泳道1：内对照和p16外显子2阳性标准；泳道2：第二外显子缺失(只扩增出755 bp β-珠蛋白片段)泳道3、4、5、6、7 第二外显子无缺失(二条带均扩出)

图5p16基因外显子1甲基化。泳道1、2、3、4 为内对照(755 bp β-珠蛋白片段)；泳道5、7 扩出336 bp示第一外显子甲基化；M：核酸分子量标记pBR322/MSP I

3．RT PCR检测myc基因的表达：为达到科研严谨性，扩增癌基因myc基因时，同时加入β-MG珠蛋白基因为内参照。

RNA提取：取米粒大小活检组织-80℃保存，放入0.5 ml离心管内，加50 μL RNA裂解液后捣碎组织，混匀再加150 μL裂解液充分震荡溶解，离心12 000 r/min(4℃)15 min。移上层液相于另一新0.5 ml离心管内，再加3倍体积无水乙醇，-20℃冰内停置30 min或-30℃过夜，当日/次日(4℃)离心12 000 r/min 10 min，弃去上清，80%乙醇清洗1次，离心(4℃) 12 000 r/min 10 min，弃上清，干燥后加水(工作水)10 μL，溶解RNA。

RT反应扩增（逆反转录PCR，RNA-cDNA）：①取3～5 μL RNA、dNTP 2 μL (2.5 mmol/L)、AMV酶2 U(8U/ μL)、AMV缓冲液2 μL，随机引物（RP 1 μL)、RNasin 1 μL(6 U/ μL)补水至10 μL；②放置室温10 min，42℃水浴30 min，95℃ 5 min，迅速放置 -20℃冻存或PCR扩增用。

RTPCR扩增：①反应体系25 μL：取3～5 μL上述反应产物，dNTP 2 μL、10×buffer 2.5 μL，myc基因通用引物各20 pmol/L(各1 μL),内对照引物β2-MG引物各1 μL(20 pmol/L),补水至25 μL体积；②扩增条件：9