【摘要】目的探讨人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染在中耳胆脂瘤发生发展中的作用。方法运用共同引物聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和核酸分子斑点杂交法对44例（44耳）中耳胆脂瘤标本组织中的HPV DNA进行检测，并结合其中35例（35耳）的病理学检查结果进行对比分析。结果 12 耳（34.3%）中耳胆脂瘤组织中观察到了HPV感染的损害特征；用共同引物PCR法及核酸分子斑点杂交法对44耳中耳胆脂瘤组织标本进行HPV DNA扩增的阳性率分别为29.5%（13/44）及25.0%（11/44）；表现有人乳头瘤病毒损害特征的12耳中耳胆脂瘤组织HPV DNA检测阳性率为58.3%（7/12），而无此损害特征的23耳中耳胆脂瘤组织HPV DNA检测阳性率为13.0%（3/23），统计学检验差异有显著性(χ²=7.926，P＜0.005)。结论HPV感染可能激发中耳胆脂瘤上皮的分裂增殖，在中耳胆脂瘤发生发展中起一定的作用；侵蚀性乳头瘤样生长和空晕细胞改变可以作为中耳胆脂瘤组织中HPV感染的病理学证据。

Expression of human papillomavirus DNA in cholesteatoma of the middle ear

BAI YanxiaYAN LiyingLI Suiqin

（Department of Otorhinolaryngology, First Hospital Of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061, China）

【Abstract】ObjectiveTo reveal the role of HPV in the occurrence and development of cholesteatoma of the middle ear. MethodPCR and nuclear acid hybridization were applied in screening 44 cases of middle ear cholesteatoma for detection of HPV DNA, and a comparison analysis with the pathological results of 35 cases of middle ear cholesteatoma was made. Results Pathologically, the characteristics of HPV induced-lesions was found in 12 of 35 specimens (34.3%). 44 cases of middle ear cholesteatoma were examined with consensus primers PCR and digoxigenin labeled HPV general probes. HPV DNA positive rates were 29.5%(13/44) and 25.0% (11/44) respectively. HPV DNA positive rate was 58.3% (7/12) and 13.0% (3/23) respectively in 12 cases with pathological characteristics of HPV induced-lesions and in 23 cases without those characteristics. There was significant difference(χ²=7.926, P＜0.005). Conclusions HPV infection can arouse the cleavage and proliferation of cholesteatoma epithelium and may play certain role in the occurrence and development of middle ear cholesteatoma. Aggressive, papillomatous growth and koilocytes can be served as the initial proof of HPV infection in cholesteatoma of the middle ear.

【Key words】Cholesteatoma，middle ear； Papillomavirus，human； Polymerase chain reaction； DNA probes，HPV

胆脂瘤型中耳炎常引起严重的并发症，100多年来的研究表明中耳胆脂瘤的形成、发生、发展是一个相当复杂的多阶段、多因素作用的过程。近年来病毒感染在胆脂瘤型中耳炎发病机理中的作用日益引起人们的重视。本研究检测了44例（44耳）中耳胆脂瘤标本组织中人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA的表达情况，以探讨HPV感染在中耳胆脂瘤发生发展中的作用及相关关系。

材料和方法

一、研究对象

44例（44耳）中耳胆脂瘤标本于1997年9月～1998年9月分别取自西安交通大学第一、二医院、第四军医大学西京医院、陕西省人民医院及解放军323医院耳鼻咽喉科。患者年龄11～56岁，平均23.5岁。临床诊断为慢性化脓性中耳炎胆脂瘤型，病理诊断为中耳胆脂瘤。样品均为无菌采集的新鲜标本，－70℃冻存备用。

二、病理检查

取10%甲醛固定的中耳胆脂瘤组织标本共35例（35耳），取检24 h内制片，常规脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色，光镜下观察。

三、组织DNA的提取

每例中耳胆脂瘤标本取组织10～30 mg，按常规酚氯抽提法提取组织DNA。

四、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增HPV DNA

1. HPV共同引物由北京医科大学病理系设计合成，位于HPV L1区，其序列如下，扩增片段长度为449 bp。

5′-GC(AC)-CAG-GG(AT)-CAT-AA(CT)-AAT-GG-3′

3′-CGT-CC(AC)-A(AG)(AG)-GGA-(AT)AC-TGA-TC-5′

2. 反应总体积为25 μL，在0.5 ml灭菌离心管内依次加入10×Buffer 2.5 μL，4×dNTP 1 μL，20 μmol/L引物1和引物2各0.5 μL，Taq 酶0.5 U，模板DNA 10 μL（0.4μg）及双蒸去离子水 10 μL，将各成分混匀后进行PCR循环，反应条件为94℃总变性3 min；94℃ 30 s 、58℃ 1 min循环35次；最后在72℃延伸5 min。取10 μL PCR扩增产物加2 μL载样示踪液溴酚蓝，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。每组实验均设阳性对照（宫颈癌caski细胞株）及阴性对照（健康人外周血淋巴细胞DNA）。

五、地高辛标记的核酸分子斑点杂交

1. 地高辛-dUTP标记HPV通用型探针由北京医科大学病理系设计合成，为随机引物法掺入的cDNA探针。

2. 取待测组织DNA各3 μL，分3次点在尼龙膜上，室温晾干后置于紫外灯下照射3 min使DNA变性，80℃干烤2 h后备用。用宫颈癌caski细胞株DNA为阳性对照，健康人外周血淋巴细胞DNA为阴性对照。

3. 将点样膜于68℃预杂交2 h后于同样温度下与煮沸变性的HPV通用型探针杂交过夜。用2%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），0.1×SSC液^［1］于室温下洗膜2次，每次5 min；用0.1% SDS，0.1×SSC液于68℃振荡洗膜2次，每次15 min；最后进行免疫检测，以紫蓝斑为阳性。

结果

一、病理学检查结果

35耳中耳胆脂瘤标本组织中12耳（34.3%）观察到了人乳头瘤病毒感染的损害特征——上皮侵蚀性乳头瘤样生长和空晕细胞改变：其中单纯上皮侵蚀性乳头瘤样生长5例，单纯空晕细胞改变2例，两种特征同时存在者5例（图1，2）。

二、HPV共同引物PCR检测结果

对44耳中耳胆脂瘤活检标本组织进行HPV DNA扩增，其阳性率为29.5%（13/44）。扩增产物在449 bp附近出现与设计预期大小一致的荧光带。阳性对照用宫颈癌caski细胞株DNA，在449 bp处出现单一扩增条带；阴性对照以健康人外周血淋巴细胞DNA为模板，未见扩增条带；并以PCR标准分子量作对照。经1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。

三、地高辛-dUTP标记HPV通用型探针的核酸分子斑点杂交结果

对44耳中耳胆脂瘤组织进行DNA斑点杂交，阳性率为25.0%（11/44）。宫颈癌caski细胞株DNA杂交结果为阳性，健康人外周血淋巴细胞DNA杂交结果为阴性，结果如图4所示。

四、病理检查与HPV DNA检测结果的关系

将PCR及斑点杂交结果均为阳性者统计为HPV DNA检测阳性例数，44耳中HPV DNA检测阳性共11例，即斑点杂交结果为阳性的11例PCR扩增结果也均为阳性。12耳表现有HPV损害特征的中耳胆脂瘤组织中7耳为HPV DNA检测阳性（7/12，58.3%），而其余23耳中耳胆脂瘤组织中仅3耳为HPV DNA检测阳性（3/23，13.0%），前者HPV DNA检测阳性率高于后者，统计学检验差异有显著性（χ²=7.926，P＜0.005）。另1例HPV DNA检测阳性病例因组织量太少未能行病理学检查。单纯PCR扩增阳性的2例组织中均未观察到HPV感染的损害特征。

讨论

通过对已确定HPV为其病因的疾病（如尖锐湿疣等）的大量病理学观测，人们认识到侵蚀性乳头瘤样生长和过度角化的表皮层中空晕细胞（又称匙状细胞）的出现为HPV损害的典型病理特征^［2］。研究认为代表HPV感染组织学特征的空晕细胞是成熟HPV在宿主细胞内大量繁殖引起细胞营养耗竭、组织变性的结果；从分子水平解释认为其机理是HPV E4蛋白与细胞角蛋白相互作用导致细胞骨架破坏而形成的^［3］。Stremlau等^［4］对中耳侵蚀性胆脂瘤的组织学观察发现，在其上皮生长的区域有典型诱发的乳头状瘤或尖锐湿疣的图像，即侵蚀性乳头瘤样生长和空晕细胞改变。本组35例标本的病理学检查结果与Stremlau等的研究结果基本一致，表明HPV感染的特征性表现在部分中耳胆脂瘤上皮中确实存在。

1994年Bergmann等^［5］应用共同引物PCR法和HPV₁₁型寡核苷酸探针进行Southern-blot杂交，检测了45例中耳胆脂瘤组织中的HPV DNA，其阳性率为36%，本实验结果与Bergmann等的研究结果基本一致。此外，一般说来HPV需要一定的条件才能复制，并导致侵蚀性乳头瘤样生长，而单纯的检测到HPV DNA似乎并不能说明这一点。Stremlau等^［4］运用Southern-blot杂交法证实在4例侵蚀性中耳胆脂瘤的空晕细胞改变区域有类似HPV₁₁的DNA，而且认为被角化上皮覆盖的回缩袋、角化上皮与粘