【摘要】目的观察水杨酸钠对豚鼠耳蜗外毛细胞(outer hair cells，OHC)内游离钙浓度 ［Ca²⁺］i的影响，并对钙通道调控药物的拮抗作用进行观察，以深入探讨水杨酸钠耳毒性的分子生物学机制。方法豚鼠全身麻醉后断头活杀，酶-机械法分离获得耳蜗单离OHC。10 μmol/L的 Fluo-3/AM负载30 min后用ACAS Ultima 型激光扫描共聚焦显微镜观察不同药物灌流下OHC［Ca²⁺］i 的变化。结果OHC在标准细胞外液灌流过程中［Ca²⁺］i保持稳定。1 mmol/L水杨酸钠灌流致8/10个细胞的［Ca²⁺］i 明显升高。无钙细胞外液中灌流亦有10/10个细胞［Ca²⁺］i明显的升高。经3 mmol/L利多卡因作用1 h后，水杨酸钠灌流不能使细胞［Ca²⁺］i升高（n=10）。盐酸氟桂嗪可以明显阻断水杨酸钠导致的OHC［Ca²⁺］i升高效应(3/12细胞的［Ca²⁺］i升高), 而尼莫地平无此效应(7/7细胞的［Ca²⁺］i升高)。结论水杨酸钠可以导致OHC［Ca²⁺］i明显增加，OHC［Ca²⁺］i 升高来源于细胞内钙库的动员和释放。使细胞内［Ca²⁺］i升高可能是水杨酸钠的耳毒性机制之一。

Sodium salicylate induced intracellular Ca²⁺ concentration change in guinea pig outer hair cells

LI Shuhua， HAN Dongyi，YANG Weiyan（Department of Otorhinolaryngology Head Neck Surgery, PLA General Hospital, Beijing 100853, China）

【Abstract】ObjectiveIn order to explore the mechanism of sodium salicylate ototoxicity the effect of sodium salicylate on intracellular Ca²⁺ (［Ca²⁺］i ) of the outer hair cells(OHCs) and the effects of calcium channel antagonist on sodium salicylate-induced［Ca²⁺］i changes of the OHCs were examined. MethodsThe OHCs of guinea pig cochlear were isolated using an enzyme-machine methods and loaded with 10 μmol/L Fluo-3/AM for 30 min at 37 ℃. Individual Fluo-3 loaded OHC was examined with a confocal microscope (ACAS ultima, USA) using a 20 x objective lens and linear scan mean. The fluorescent images, collected each 5-sec for 300 sec, were stored in a computer. The fluorescent intensity of the OHCs were analyzed by the software cooperated with the confocal microscope, and a curve of fluorescent intensity changes trend against time was obtained. Results The［Ca²⁺］i of OHCs were steady under normal extracellular liquid perfusion. Salicylate increased ［Ca²⁺］i in OHCs in calcium-free medium(10/10) and standard medium (8/10). 3 mmol/L lidocaine inhibited ［Ca²⁺］i increase in OHCs induced by salicylate(0/10). The［Ca²⁺］i increase in OHCs induced by salicylate could be blocked by flunarizine(3/12). Nimodipin failed to block the［Ca²⁺］i increase of OHCs induced by salicylate (7/7). ConclusionSodium salicylate can result in ［Ca²⁺］i increase in OHC markedly，which may be due to the Ca²⁺ release from intracellular calcium stores. The effects of salicylate on［Ca²⁺］i in OHCs might be one of the mechanisms of salicylate ototoxicity.

【Key words】Cochlea；Hair cells,outer； Calcium； sodium salicylate；Lidocaine； Flunarizine；Nimodipine

临床上水杨酸钠广泛用于解热、镇痛及抗炎治疗，在治疗风湿热和其它结缔组织疾病时所使用的剂量常导致耳鸣和听力下降。在一定范围内，听力损失的程度随水杨酸钠在血浆中的浓度增加而加重^［1］。水杨酸钠的耳毒性不同于氨基糖甙类抗生素和髓袢类利尿剂，耳鸣和听力下降一般在停用水杨酸钠24～72 h后消失。

鉴于水杨酸钠易致耳鸣，目前多利用水杨酸钠制作耳鸣的动物模型。大鼠的行为观察实验表明，水杨酸钠可使大鼠表现出耳鸣时的行为^［2］。已证实，动物被注射水杨酸钠后，其听神经的自发性放电频率明显增加，但使用利多卡因后恢复至正常水平^［3］。但水杨酸钠使动物听神经放电频率增加的细胞生物学机理尚不甚清楚。近来已证实，细胞内游离钙在听觉信号传输过程中起重要作用。我们用单离的豚鼠耳蜗外毛细胞(outer hair cells, OHC)作对象，观察了水杨酸钠对OHC内游离钙浓度(［Ca²⁺］i)的影响，并对目前治疗耳鸣药物的拮抗作用进行了观察，旨在深入探讨耳鸣的分子生物学机制。

材料与方法

1．实验动物及耳蜗OHC的分离：用耳廓反射阳性，体重200～300 g的豚鼠12只。全身麻醉后断头活杀，解剖出双侧听泡，立即置入细胞外液中进行操作。解剖显微镜下剥离蜗壳，撕去螺旋韧带，以不锈钢针和游丝镊仔细解剖分离出基底膜，并置入含0.1 mg/ml胶原酶（Sigma公司, 美国）的细胞外液中孵育15 min后更换含2 g/L牛血清白蛋白(Sigma, 美国)的正常细胞外液。在解剖显微镜下以角膜剪将基底膜组织剪碎并以吸管吹打，即获得单离的OHC 60～100个。从每侧耳蜗分离的OHC均分3等份，分别移入预先在皿底涂上细胞粘着剂（0.25 mg/ml刀豆蛋白，Sigma公司，美国)的玻璃皿内备用。

2．Fluo-3的染色及钙成像：钙荧光探针Fluo-3/AM(Molecular Probe,美国)用纯二甲亚砜（dimethylsulfoxide, DMSO）配成1 mmol/L的储备液，低温保存备用。分散剂F-127(Molecular Probe,美国)以溶于纯DMSO中(20 mmol/L)备用。实验前将Fluo-3/AM与F-127储备液以4∶3体积比混于细胞外液中，Fluo-3/AM的终浓度为10 μmol/L。单离细胞在37℃下避光孵育约30 min，更换新鲜细胞外液即可用于观察。实验采用ACAS Ultima 型激光扫描共聚焦显微镜（laser scan confocal microscope, LSCM，Meridian公司，美国）。以LSCM观察用Fluo-3/AM染色后的OHC［Ca²⁺］i的变化。用20倍物镜，线扫描方式荧光图像由冷电荷藕荷器件摄像记录，经模-数转换储存于计算机内，每5 s记录1次，每个细胞记录300 s。

3．溶液、试剂及给药方法：正常细胞外液的组成（单位：mmol/L）：NaCl 150； KCl 5； CaCl₂ 2； MgCl₂ 1；Hepes 10； D-葡萄糖 5。用电子分析天平(Sartorius A 120S，Sartorius公司,德国)称量各种成分(北京化学试剂三厂)，用三蒸水配制。用pH试纸及酸度计(PHS-29A型，上海第二分析仪器厂)测定，并以1 mmol/L NaOH 和1 mmol/L HCl 将pH值调至7.4。全自动冰点渗透压计(FM-6型，上海第一医科大学仪器厂)测定，并用1 mol/L NaCl 及三蒸水调节渗透浓度到（300±5）Osm mol/L。无钙细胞外液组成则以1 mmol/L的EGTA(Ethylene Glycol-bis N,N,N′,N′-tetraacetic Acid,Sigma公司，美国）取代上述溶液中CaCl₂。水杨酸钠、利多卡因、盐酸氟桂嗪（Sigma公司，美国）等试剂均于实验前加入标准细胞外液或无钙细胞外液中备用，尼莫地平预先以高浓度溶于无水乙醇内并在实验前加入细胞外液至所需浓度。各溶液的渗透浓度均调至300 Osm mol/L左右。

整个实验过程约需5 min。以蠕动泵持续灌流更换玻璃皿中的细胞外液，蠕动泵流速为400 μL/min，其中第1 min灌流正常细胞外液，第2～3 min灌流含一定浓度所用药物的细胞外液，第4～5 min重新灌流细胞外液，每个玻璃皿内的细胞只使用一次。

4．数据处理：LSCM所配微机存储下的荧光图像，由Meridian公司提供的配套软件计算特定区域的荧光强度值，并绘制荧光强度随时间变化的曲线。Fluo-3/AM的钙解离常数为0.39 μmol/L，适用于测量较高浓度的钙离子。Fluo-3与钙离子结合后荧光强度增加40倍，但发射光的波长仅轻微改变^［4］，未经校正不能计算细胞内钙离子浓度的绝对值，故本文仅观察所绘出曲线的升降趋势。

5．细胞活性鉴定：判定细胞活性正常的标准为细胞双折射现象存在，细胞核位置正常，细胞无水肿，细胞内无布朗运动的颗粒^［5-7］。

结果

1．单离OHC的形态特征：图1为单离的OHC。单离的OHC呈柱状，长度约40～70 μm不等。在相差显微镜下其细胞体呈半透明状，细胞器主要分布于表皮板下及核下，细胞核位于底部。实验中以前述细胞活性鉴定标准选用活性良好的细胞观察。

2. OHC的钙成像：激光共聚焦显微镜下钙成像的OHC仍可见普通倒置显微镜下的形态特征，细胞内游离钙离子浓度的高低由细胞被激发出的荧光的强弱表示(图2)，越偏红表示细胞内游离钙离子浓度越高，越偏蓝则越低。

3. 静息状态下正常OHC［Ca²⁺］i的动态变化：为证明灌流的细胞外液对OHC ［Ca²⁺］i的影响，在11个单离OHC观察了标准细胞外液灌流过程中［Ca²⁺］i的动态变化。结果表明，细胞外液灌流的整个时间内OHC［Ca²⁺］i 保持稳定(图3)。

4．水杨酸钠对OHC［Ca²⁺］i的影响：在有钙和无钙细胞外液中各观察了10个细胞灌流1 mmol/L水杨酸钠时OHC［Ca²⁺］i的变化。结果表明，在有钙和无钙细胞外液中灌流水杨酸钠即<