【摘要】目的探讨神经生长因子(nerve growth factor，NGF)对豚鼠噪声性听力损伤的防治作用。方法豚鼠每天暴露115 dB(A)白噪声连续6 d (45 min/d），在暴露全部结束后不同时间(1 h、1 d、2 d、3 d和6 d)分别测试皮层反应阈，并用透射电镜观察耳蜗螺旋器细胞内变化。结果A(每日肌内注射NGF 1 000 U/kg体重)、B(每日肌内注射NGF 2 000 U /kg体重)和C(每日肌内注射NGF 3 000 U/kg体重)3个实验组动物听反应阈偏移幅度均小于生理盐水对照组(每日肌内注射1 ml/kg体重)，差异有非常显著性意义（方差分析，P值均＜0.01）；实验B、C两组动物在噪声暴露后3 d听反应阈已基本恢复，而对照组动物在噪声暴露后6 d仍有（16.43±6.91）dB(±s)的阈移。透射电镜观察显示，对照组耳蜗病变在3排外毛细胞，以底回末段损伤最重，主要有纤毛内微丝解聚、线粒体肿大和毛细胞轻度水肿；外毛细胞表面下池和传出神经末梢也有轻度肿胀的表现。实验A组耳蜗病变程度比对照组轻，多局限在第3排外毛细胞。而实验B、C两组动物内耳损伤甚微。结论在慢性声损伤中，外源性NGF能够减轻噪声对耳蜗毛细胞的损害，对噪声性听力损伤具有较明显的保护作用。

Amelioration of nerve growth factor against noise-induced threshold shift: a transmission electron microscope observation

RUAN Fangming，WANG Haiming，GAO Wenyuan

（Department of Navy Hygiene, Faculty of Navy Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China）

【Abstract】ObjectiveTo study the protective effects of nerve growth factor(NGF) on noise-induced hearing damage in guinea pigs. MethodsNGF injected Guinea pigs were consecutively exposed to white noise of 115 dB(A) for 6 days continually (45 min·d^-1). Auditory thresholds were measured using auditory cortex evoked response to tone bursts in different post-exposure intervals (1 h, 1 d, 2 d, 3 d and 6 d). The ultrastructural changes within hair cells were also observed by a transmission electron microscope(TEM). Results The auditory threshold shifts in test group A(NGF:1 000 U·kg^-1.d^-1, im.), B(NGF:2 000 U·kg^-1.d^-1,im.) and C( NGF:3 000U·kg^-1.d^-1,im.) were significantly fewer than that in the control group(Saline:1 ml·kg^-1.d^-1,im). Threshold shifts almost recovered in test group B and C 3 days after the exposure; while a threshold shift of (16.43±6.91) dB was present 6 days after the exposure in the control group. TEM showed that all three rows of the outer hair cells(OHCs) of the basal turn in the control group displayed significant pathological changes. Depolymerization of actin filiaments within stereocilia, swelling of submembraneous cistern and the efferent nerve-ending and slight edema of hair cells were evident. In test group A, the hair cells display slight pathological changes, which are confined in the third row of OHCs in a local position of the basal turn. In group B and C hair cells have nearly normal appearance. ConclusionNGF is able to reduce threshold shift, and promote the recovery of auditory threshold in acoustic trauma. This factor can, to some extent, protect against noise-induced hearing damage.

【Key words】Nerve growth factors； Hearing loss，noise-induced；Cochlea；Hair cells,outer

噪声可致人耳听力损害，连续噪声对听力的损害一般经历从可逆性病变发展到不可逆性病变的过程，在症状上表现为从可恢复的暂时性阈移(temporary threshold shift，TTS)转变为不可恢复的永久性阈移(permanent threshold shift，PTS)，其实质是耳蜗内听觉感受器在噪声刺激下发生变性、坏死的结果。对于噪声性听力损伤的防治方法以往已在增加血流量、供给高能化合物及供氧、提高对噪声的耐受力等方面进行了研究^［1，2］。但是，对于噪声引起的外周听觉感受器损伤迄今尚无理想的防治方法。最近有研究表明，神经营养因子(neurotrophic factors，NTF)对氨基糖甙类药物引起的听力损伤具有一定的保护作用^［3，4］。我们的实验是在豚鼠每天噪声暴露前肌内注射不同剂量的神经生长因子(nerve growth factor，NGF)，通过观察皮层听反应阈及耳蜗毛细胞内的变化，对NGF有无防止损伤及促进听力恢复的作用进行探讨。

材料与方法

1. 主要试剂和仪器：NGF(沉降系数2.5，相对分子质量14 000)为雄性小鼠颌下腺提取物，其生物活性为1.0×10⁵ U/mg蛋白(第二军医大学神经生物学教研室提供)；H-800透射电子显微镜(日本)；便携式听觉诱发电位仪(Traveler公司，美国)；B&K 1027型无规信号发生器(丹麦)。

2. 动物分组与处理：选择耳廓反射正常的健康杂色雄性豚鼠30只(第二军医大学实验动物中心提供)，体重(274.64±19.9) g(±s)；2只豚鼠作为电镜观察的正常对照标本，其余28只先按原始体重由小至大编号后，按体重平均随机分为4组，每组7只(14耳)。各组豚鼠在戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔麻醉和无菌条件下于双侧皮层听区硬膜外手术埋植不锈钢丝慢性电极，牙科水泥固定，稳定1周后进行实验。

3. 噪声暴露：4组动物每天用药后即行白噪声暴露。将动物置于小笼内(20 cm×20 cm×20 cm)，每笼1只，放入暴露舱(26 m³)^［5］，由信号发生器产生20 Hz～20 kHz的白噪声，经GY型400 W扩音机放大，并由扬声器组向暴露舱播放。暴露时用B&K.2107型频率分析仪连续监测。暴露声压级为115 dB(A)，动物暴露范围内声场不均匀度为±1 dB(A)。每日暴露1次，每次45 min，连续暴露6 d。

4. 听反应阈测试：动物清醒状态，半限制于测试笼中，置于隔声电屏蔽室内。用便携式听觉诱发电位仪测定皮层短声诱发电位；刺激声能量主要集中在2～4 kHz；由0.1 ms的方波输入扬声器产生，诱发生物电信号通过机内前级放大器放大10 000倍并进行信息处理。扫描时间100 ms，重复率1次/s，带通滤波10～300 Hz，叠加30次。短声以5 dB步级衰减，以刚能出现皮层电位的短声强度为皮层反应阈。扬声器正对豚鼠一侧耳，与耳相距3 cm。对侧慢性电极为记录电极，额部近中线处鼻骨旁慢性电极为参考电极，口腔上唇粘膜接地。各组动物在第一次噪声暴露前和噪声暴露全部结束后(1 h、1 d、2 d、3 d和6 d)分别测试听皮层反应阈。

5. 动物用药(每天在噪声暴露前15 min)：对照组动物肌内注射生理盐水(1 ml/kg体重，每日1次)；实验A组动物每日肌内注射NGF 1 000 U/kg体重，实验B组动物每日肌内注射NGF 2 000 U/kg体重；实验C组动物每日肌内注射NGF 3 000 U/kg体重。

6. 透射电镜标本制作及观察：4组动物全部左耳耳蜗及2只正常对照动物(不经给药及噪声暴露，听反应阈正常的动物左耳耳蜗)作为透射电镜观察对象(右耳耳蜗用于琥珀酸脱氢酶活性染色^［5］)。在每只动物完成最后一次噪声暴露及皮层反应阈测试后(实验开始后6 d)立即断头，提取颞骨，在解剖显微镜下打开听泡，取出全长骨螺旋板及基底膜，用2.5%戊二醛固定，10%乙二胺四乙酸二钠脱钙后，再经4%多聚甲醛固定4 h，在0.1 mol/L磷酸缓冲液中漂洗3次，每次10 min，于1%锇酸固定2 h，再经磷酸缓冲液漂洗、丙酮系列脱水和Epon812环氧树脂浸透、包埋及60℃聚合。先用半薄切片，相差显微镜观察定位，再行超薄切片，铅、铀染色后，用透射电镜观察耳蜗螺旋器细胞内的超微结构变化。

7. 统计学处理：实验数据以±s表示，采用完全随机设计资料的方差分析进行显著性检验。

结果

1. 听反应阈改变：受试动物经115 dB(A)稳态噪声连续暴露6 d后，对照组和3个实验组均有听力损失(B组动物实验期间死亡1只)，表现为听反应阈上移，其中以对照组最为明显，实验A组次之。噪声暴露停止为1 h(实验开始后第6 d)，对照组动物平均阈移为（35.36±9.09）dB，其中最大阈移达50 dB。按完全随机设计多个样本均数比较的方差分析表明，噪声暴露全部结束后的1 h、1 d、2 d、3 d和6 d，3个实验组阈值与对照组相比，除噪声暴露结束后1 h，A组与对照组差异无显著性外，差异均有非常显著性(P＜0.01)，但B组与C组间阈值则差异无显著性(P＞0.05)；而A组与C组之间的阈值在暴露结束后1 h、1 d和2 d差异有显著性(P＜0.05)，在暴露结束后3 d和6 d，实验A组与实验B、C组之间则差异有非常显著性(P＜0.01)。4组动物在噪声暴露前和噪声暴露全部结束后不同时间的听反应阈见参考文献［5］。在噪声暴露结束后3 d，B、C两组听反应阈已接近正常，6 d完全恢复至暴露前水平；但A组在噪声暴露结束后3 d和6 d分别还有(11.43±6.02)dB和(8.21±5.41)dB的阈移；而对照组在噪声<