【摘要】目的探讨大鼠鼻粘膜P物质受体(substance P receptor, SP-R) mRNA的表达水平及其与变应性鼻炎的关系。方法选健康Wistar大鼠20只，雌雄不限，随机分为实验组和对照组各10只。实验组用卵清蛋白行腹腔注射基础致敏，继之鼻局部激发建立大鼠变应性鼻炎模型。以β-肌动蛋白（β-actin）作内标准，利用逆转录-多聚酶链反应(reverse transcriptive polymerase chain reaction, RT-PCR)，对变应性鼻炎模型组和对照组大鼠鼻粘膜SP-R mRNA进行了定量研究。同时利用地高辛标记的cDNA探针对其行Southern杂交鉴定。结果对照组和实验组大鼠鼻粘膜中均有SP-R mRNA表达,但实验组大鼠中SP-R mRNA表达量较对照组明显增多(P＜0.05）。结论变应性鼻炎鼻粘膜SP-R mRNA表达量增多，提示SP-R mRNA表达上调在变应性鼻炎的发生发展中起作用。

Expression of substance P receptor mRNA in nasal mucosa of rat in allergic rhinitis model

XUE Jinmei，ZHAO Hailiang，AN Yunfang（Department of Otorhinolaryngology , Second Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China）

【Abstract】Objective to study the expression of substance P receptor messenger RNA (SP-R mRNA) in nasal mucosa in allergic rhinitis (AR) rat model. Methods Twenty Wistar rats free of disease were randomly divided into two groups. AR model rats were established through repeated intraperitoneal shot of ovalbumin (OV) and consequently confirmed by local challenge with OV. SP-R mRNA in nasal mucosa, obtained from two groups, were used to do reverse transcriptive polymerase chain reaction (RT-PCR) and Southern blot. β-actin was used as a standard control through out the whole process. ResultsThe results showed definitely that there were positive expression of SP-R mRNA in normal nasal mucosa. This expressions increased significantly (P＜0.05) during nasal allergy. ConclusionIncreased expression SP-R mRNA in nasal mucosa in AR model might play roles in the development of AR.

【Key words】Rhinitis,allergic,nonseasonal；Receptors,neurokinin-1；Molecular biology；Rat

神经肽及受体与变应性鼻炎的关系是鼻超敏机制研究领域的一个重要内容，P物质（substance P，SP）通过与其特异性受体结合而发挥病理生理作用^［1］，受体数量和功能的变化影响自身及组织器官的功能^［2］。受体转录水平的调控是其基因表达过程中最重要的调控机制之一。本组对变应性鼻炎模型SP-R mRNA进行定量研究,报告如下。

材料和方法

一、动物造模及组织制备

选健康Wistar大鼠20只，雌雄不分，体重160～210 g，随机分为2组，每组10只，1组为实验组，另1组为健康对照组。实验组动物以卵清蛋白(Sigma，美国)0.3 mg，辅以氢氧化铝30 mg作佐剂，行腹腔注射基础致敏，隔日1次，共7次。再用2％卵清蛋白50 μL/侧滴鼻做局部激发,每日1次，共7次。对照组动物以生理盐水代替卵清蛋白，其余方法和步骤相同。在末次激发后10 min，以1％戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，腹主动脉放血致死，迅速取鼻呼吸区粘膜, 用4℃生理盐水冲净血液及粘液，随机将其1侧放入4%多聚甲醛和0.25%戊二醛混和液中固定,行HE染色及1%甲苯胺蓝染色；另侧放入Eppendorf管中，置于-196℃液氮中冻存，供提取总RNA使用。

二、总RNA的提取

采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法^［3］。鼻粘膜组织在液氮中冷冻，然后加入变性液（4 mmol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠，pH 7.4，0.5%十二烷基肌酸钠，0.1% 2-巯基乙醇）研磨，苯酚-氯仿抽提。离心后将存在于水相中的RNA用异丙醇（isopropanol）沉淀，得到的RNA溶解于焦碳酸二乙酯（DEPC）水中。

三、反转录-聚合酶链反应（reverse transcriptive polymerase chain reaction，RT-PCR）

1．反转录（RT）、cDNA第一链的合成：将上述RNA用无RNA酶的DNA酶(RQ1 rNase-free DNase， 1 μL/μg RNA；Promega，美国)37℃孵育1 h，以酚-氯仿抽提，乙醇沉淀纯化。cDNA第一链合成反应在20 μL的体系中进行：加5 μL 总RNA至6 μLDEPC处理的水中，加入1 μL Oligo（dT）17引物（5′-CCAAGCTTGGATCCGAATTG(T)17 -3′）混匀，65℃温育10 min。冰上冷却2 min。加入5×第一链缓冲液(5×first strand buffer) 4 μL dNTP 混合物(10 mmol/ μL)1 μL，DTT(0.1 mol/L)2 μL，混匀，42℃ 2 min。最后加入1 μL 逆转录酶( AMV-RTase，5 U/ μL)，42℃孵育1 h，-20℃保存。

2.聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）:① 目的基因SPR的扩增:用上述cDNA作为模板,用引物1与引物2进行PCR, 循环25周期。引物1：5′-CTCCGGCCACTCGATCATGCA-3′；引物2：5′-GGCTGGAGAGGGTGGATGAT-3′；② 内标准β-肌动蛋白（β-actin）的扩增：以上述cDNA第一链为模板，用引物3和引物4进行PCR，循环35周期。引物3：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′；引物4：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。扩增产物经1.5% 的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，凝胶分析系统（GDS-8000,美国）照相分析。Oligo（dT）17，引物1～4 由宝生物工程（大连）有限公司合成。

四、目的片段的酶切鉴定

取SPR 的PCR 扩增产物16 μL，用RsaI酶(Promega，美国)2 μL及相应缓冲液2 μL,37℃水浴1 h酶切，电泳，EB染色，观察结果并照相。

五、PCR产物定量

以β-actin基因片段为内标准，在GDS-8000 (Ultra-Violet，美国) 凝胶成像分析系统下照相，用Gel-work软件对SPR基因扩增产物进行密度扫描定量分析,测量扩增条带的强度和面积，两者乘积即为表达的相对强度。两样本均数差异显著性通过 Minitable软件用t检验法测试。

六、探针的制备及其纯化

以含SPR的pCDNA3 质粒(美国Haravd教授馈赠)为模板，加入引物1和引物2，利用Dig-PCR-Kit(Boehringer Mannheim，德国)试剂盒标记。PCR产物（探针）用WizardTM PCR Preps DNA 纯化系统（Promega，美国）纯化。将PCR 产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，在长波紫外灯下切下含目的DNA 的条带，置于1.5 ml Eppendof 管中，70℃温育融化，加入1 ml树脂，混匀，经柱滤过，再加2 ml 的80％异丙醇清洗后，加入50 μL双蒸水,12 000 r/min离心收集，获得纯化的目的片段（探针）。

七、Southern印迹杂交

将所扩增目的片段电泳，溴化乙锭染色，采用真空转迹至尼龙膜上，利用地高辛标记探针，于68℃杂交过夜。利用化学发光底物CSPD(Boehringer Mannheim，德国)进行免疫检测，按试剂盒说明进行一系列预杂交、杂交、洗膜、曝光，观察结果并照相。

结果

一、大鼠变应性鼻炎模型的建立

10只实验动物中8只出现了典型的变应性鼻炎的症状，如频繁的喷嚏，鼻周搔痒，大量清涕及觅食减少等，这些症状在2 h后逐渐减轻。对照组仅出现轻微的喷嚏和搔鼻动作。此外，实验组动物的鼻粘膜常规HE染色显示不同程度的组织水肿，血清渗出及动脉血管扩张，肥大细胞和嗜酸粒细胞在上皮下，血管周围浸润；1%甲苯胺蓝染色可见肥大细胞沿血管壁浸润。对照组动物的鼻粘膜无嗜酸粒细胞浸润，仅见肥大细胞沿小血管壁散在分布。

二、总RNA的提取

将提取的总RNA在紫外分光光度计下测其吸光度(A）,各样品之A₂₆₀/A₂₈₀均为1.8以上，证明提取的总RNA纯度符合要求。经1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，可见明显的18 sRNA 和28 sRNA 两条带，说明提取的总RNA 完整，没有降解。

三、目的基因的定量扩增及鉴定

将总RNA用无RNA酶的DNA酶消化后，再经RT-PCR 扩增SPR目的片段和β-肌动蛋白，这样可以避免在RNA提取过程中带有极微量基因组DNA所致的假阳性。从实验组与对照组大鼠鼻粘膜SP-R和内标β-肌动蛋白的mRNA表达扩增中(图1),可见扩增SPR片段与我们预期的目的片段(374 bp)大小相符，特异性高。经酶切分析，证明该扩增片段为所要的目的基因。实验组及对照组中均有SPR表达，但实验组SPR的mRNA表达水平与对照组相比均有不同程度增高，经t检验分析,二者差异有显著性（P＜0.05），即实验组大鼠鼻粘膜SP-R mRNA水平上调。作为内标准的β-肌动蛋白(348 bp)对照组和实验组均表达恒定。

对扩增出SPR的RT-PCR产物进行Southern印迹检测，结果表明在374 bp 处有明显的杂交条带(图2），进一步鉴定上述RT-PCR产物为我们所要目的基因。且从图2可以看出实验组比对照组杂交带明显，这与上述实验组SP-R mRNA 表达量高于对照组吻合。

图1RT-PCR对鼻粘膜cDNA扩增产物的测定。β-肌动蛋白的RT-PCR产物和Mark1在 SPR和相应的Mark2之后50 min加样。琼脂糖凝胶浓度为1.8%, 1、7为100 bp<