【摘要】目的观察外毛细胞内源性钙离子的释放。方法分离豚鼠耳蜗外毛细胞， 用硫汞撒（thimerosal）为激动剂， 用钙离子敏感染料Fura-2和数字荧光显微镜观察离体外毛细胞内钙离子浓度的波动。结果硫汞撒可诱发离体耳蜗外毛细胞胞内钙离子的明显增加， 其增加程度在一定范围内与硫汞撒的浓度呈正比。在清除了细胞外液中钙离子后，硫汞撒仍可诱发离体耳蜗外毛细胞胞内钙离子浓度的升高。在此钙离子浓度升高的基础上向胞外液加入钙离子，胞内钙浓度进一步升高；它可被500 μmol/L非选择性钙通道阻断剂LaCl₃阻断。而L型电压激活的钙通道阻滞剂硝苯吡啶 对其无阻断作用。硫汞撒的作用可被巯基保护剂二硫苏糖醇阻断和逆转。 百日咳毒素 、咖啡因和理阿诺碱对硫汞撒的作用无影响。结论巯基氧化剂硫汞撒可通过两条途径使外毛细胞胞内钙离子浓度升高，一是诱发离体外毛细胞内咖啡因和理阿诺碱咖啡因和理阿诺碱不敏感的内源性钙离子释放，二是通过硝苯吡啶不敏感的非特异钙通道使钙离子从胞外内流。对巯基氧化启动的钙通道值得进一步研究。

Thiol reagent thimerosal-induced Ca²⁺ mobilization in isolated guinea pig cochlear outer hair cells

CHEN Lei，JIANG Sichang，YANG Weiyan（Department of Otolaryngology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China）

【Abstract】ObjectiveTo understand mechanism of cochlear outer hair cells (OHCs) intracellular Ca²⁺ mobilization further. MethodsIntracellular calcium of isolated guinea pig was investigated using thimerosal, a—SH group oxidizing agent, and fura-2 fluorescence ratio imaging microscopy. ResultsIn the presence of thimerosal, intracellular Ca²⁺ concentrations (［Ca²⁺］i )of OHCs were elevated in a dose-dependent manner. Even in Ca²⁺-free medium, Ca²⁺ response was still induced. The effects of thimerosal on ［Ca²⁺］i were completely blocked and reversed by(DTT). Neither 1-100 μmol/L ryanodine nor 5-20 mmol/L caffeine altered the effects of thimerosal. Pretreatment with pertussis toxin (PTX) for 30 min did not affect the thimerosal-induced increase in ［Ca²⁺］i The increase in［Ca²⁺］i when Ca²⁺ was added during thimerosal application in Ca²⁺-free medium was almost completely blocked by 500 mol/L LaCl₃ , while nifedipine did not inhibit further increase in［Ca²⁺］i caused by thimerosal. ConclusionOxidation of the -SH group of the OHC membrane can induce a Ca²⁺ release from intracellular Ca²⁺ stores, which are ryanodine- and caffeine-insensitive, and Ca²⁺ influx through non-specific Ca²⁺ channels, but not the nifedipine-sensitive Ca²⁺ Channels. The possible oxidation of -SH group gated Ca²⁺ channels in OHCs are worthy of further study.

【Key words】Hair cells, outer；Cochlea；Calcium channels；Fura-2；Thimerosal

哺乳动物耳蜗对声音刺激有非常高的敏感性和强的频率分辨力。目前认为内毛细胞感受声刺激，而外毛细胞通过其运动功能调谐螺旋器的微机械状态以增加听敏度和频率分辨力。有证据表明胞内钙离子参与调节肌动蛋白有关的外毛细胞慢运动^［1］，多种刺激物可使外毛细胞胞内钙离子浓度改变^［2，3］。但对外毛细胞胞内钙离子的释放研究甚少。了解钙离子在胞内的变化机制对了解外毛细胞的调节作用是很重要的。巯基氧化剂对钙通道的功能有影响^［4］, 中等浓度硫汞撒对胞内钙离子影响依细胞类型和剂量的不同而不同。在5～100 μmol/L的浓度下分别引起鼠胸腺细胞（thymocytes）^［5］、人内皮细胞^［6］和胸腺淋巴细胞^［7］钙离子的活动。有的实验表明硫汞撒诱发胞内钙离子浓度增加是通过增敏三磷酸肌醇受体^［8］。另外一些实验提示硫汞撒开放了胞外液钙进入胞内的通道^［6］。为揭示外毛细胞中钙离子的调节机制，在本实验中研究了离体外毛细胞内钙离子对硫汞撒的反应。

材料与方法

细胞分离：用250～300 g耳廓反射正常的健康白豚鼠，雌雄不限。断头后取出听泡，剥离耳蜗骨壳和螺旋韧带。于标准生理盐液中取出3～4回Corti器。用微吸管将所分离的组织轻柔地吸入和吹出管尖，分离成单个外毛细胞，将其置于底部涂有细胞粘附剂 cell-TAK (1 g/L, Cosmo-Bio,日本)、盛有300 μL新鲜标准生理盐水的实验皿中。向皿中加入2 μmol/L 钙离子敏感染料Fura-2/AM (Dojindom，日本) 孵育30 min。全部实验均在室温（22～24 ℃）下进行。

钙离子测量：将盛有Fura-2染料孵育的外毛细胞实验皿置于显微镜载物台上，显微镜连接高分辨微分干涉相差荧光分析系统。使用干涉和中性滤光片，半个滤波带宽10 nm, 激发光为波长340 nm 和380 nm 的75 W氙气灯，激发光被半通透波长400 nm 的二色性镜反射。从胞内发出的荧光亦透过该镜及20 nm带通，510 nm阻挡滤片。细胞内荧光被聚焦在微光摄像机上并输入钙离子影像实时分析系统（Argus-100/CA，滨松光电研究所，日本）。细胞内钙离子浓度用波长340 nm和380 nm的荧光强度比率表示：340 nm激发光荧光强度增加，同时380 nm激发光荧光强度减低，说明钙离子浓度升高，反之说明钙离子浓度下降。钙离子浓度经体外较正换算得出^［9］。

细胞分离和胞内钙离子浓度的观察均以标准生理盐液为毛细胞的外环境溶液，标准生理盐液 (mmol/L)：NaCl 150, KCl 5, K₂HPO₄ 0.2, MgCl₂ 1, 葡萄糖5, CaCl₂ 1, Tris 10。硫汞撒、理阿诺碱、咖啡因、二硫苏糖醇和LaCl₃ 分别溶解在标准生理盐液中。在无钙液中用1 mol/L 依地酸替代标准生理盐液中的CaCl₂ 。硝苯吡啶先溶于二甲亚砜中，再溶于其他溶液中。二甲亚砜的最终浓度小于0.1%。所有溶液被调至pH7.4和渗透浓度300 Osm mol/L。实验皿用300 μL/ min的速度灌流。百日咳毒素则直接加入实验皿。

统计：数值用平均值±标准差（±s）表示。用配对t检验，P＜0.05 为显著性差异。

结果

1．硫汞撒对耳蜗外毛细胞胞内钙离子浓度的影响：向实验皿中加入100 μmol/L 硫汞撒，外毛细胞内出现缓慢持续性的钙离子升高，在7 min内钙离子浓度从静息时(95.1±19.66) nmol/L升至(193.21±38.07) nmol/L，24 min时达(265.43±63.69) nmol/L(n=13，图1）。钙离子反应的潜伏期平均为(2.2±0.6) min(n=13)。用标准生理盐液灌流清除硫汞撒后，最长观察35 min 未见外毛细胞内钙离子浓度回至静息状态。可见清除胞外液钙离子，不能逆转钙离子浓度升高。

在细胞外液无钙离子的条件下，1 mmol/L 硫汞撒仍能引起外毛细胞内钙离子浓度的升高。用无钙液（含1 mmol/L 依地酸 ）灌流外毛细胞以防胞外钙离子内流补充胞内钙储存。无钙液灌流5 min后，外毛细胞内静息钙离子浓度从(93.27±18.56) nmol/L下降并稳定在(68.82±17.09) nmol/L（n=17）, 在无钙离子的外环境中，1 mmol/L 硫汞撒使外毛细胞内钙离子浓度从(68.82±17.09) nmol/L在9 min内升至(140.05 ±42.4) nmol/L，并维持这一水平（图1）。在细胞外液含钙离子和不含钙离子的条件下，硫汞撒诱发的钙离子持续增加的程度明显不同。在细胞外液钙离子浓度降低时硫汞撒引起的钙离子增加较少，增加的幅度相差约3倍。预先灌流或同时应用5 mmol/L 二硫苏糖醇能完全抑制上述反应。

图1在含钙和无钙的环境中硫汞撒(1 mmol/L)诱发离体外毛细胞胞内钙离子缓慢和持续增加（±s，n=13）

图2二硫苏糖醇对硫汞撒诱发离体外毛细胞胞内钙离子活动的作用。灌流硫汞撒 (100 μmol/L)引起离体外毛细胞胞内钙离子浓度增加，用含5 mmol/L 二硫苏糖醇液冲洗后胞内钙离子浓度下降。

2．巯基还原剂对硫汞撒作用的影响(图2)：加入5 mmol/L巯基还原剂二硫苏糖醇使100 μmol/L 硫汞撒诱发离体外毛细胞胞内钙离子浓度升高逆转。

3. 硫汞撒的浓度依赖性：硫汞撒在10 μmol/L～1 mmol/L的浓度范围诱发的外毛细胞内钙离子升高呈浓度依赖趋势，即硫汞撒浓度越高钙离子浓度升高越高且潜伏期越短（图3）。

图3离体外毛细胞胞内钙离子对不同浓度硫汞撒的反应

4．钙离子通道活性物质对硫汞撒作用的影响：在细胞外液不含钙离子的条件下，1 mmol/L 硫汞撒诱发的钙<