【摘要】目的探讨中国人非综合征性耳聋患者连接蛋白26(connexin 26, Cx26)基因突变频率和特性。方法收集中国散发先天性聋哑儿童16例，常染色体隐性遗传性聋39例(39个家系)，10岁前开始听力下降的常染色体显性遗传性聋30例(30个家系)和健康对照组100例。聚合酶链反应-单链构象多态（single strand conformational polymorphism analysis of polymerase chain reaction, PCR-SSCP）分析初筛可疑突变者，SSCP分析发现异常构象带后再行DNA测序。结果健康对照组中15例发现5种多态性改变，耳聋患者中10例发现6种多态性改变。散发先天性聋哑和常染色体隐性遗传非综合征性耳聋中未发现致病突变。1个常染色体显性遗传性聋家系发现所有患者（3例）Cx26基因的编码区299-300位碱基AT杂合性缺失，导致移码突变，翻译的蛋白质截短，该家系听力正常者无此突变。结论蒙古人种中常染色体隐性遗传性非综合征性耳聋的Cx26基因突变率可能低于其他人种。Cx26基因编码区299-300位碱基AT杂合性缺失可致常染色体显性遗传性聋DFNA3型。

Mutations in the connexin 26 gene in patients with nonsyndromic hearing impairment

XIAO Zian，FENG Yong，PAN Qian（Department of Otolaryngology & Hearing Research Laboratory, Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011, China）

【Abstract】ObjectiveTo determine the prevalence and characteristics of deafness-causing mutations in Connexin 26(Cx26,GJB2) gene in Chinese with nonsyndromic hearing impairment（NSHI）. MethodsStudy subjects are all Chinese including 16 infants with sporadic congenital deaf-mutism, 39 patients with autosomal recessive hereditary hearing loss, 30 patients with autosomal dominant hereditary hearing loss and 100 normal adults. The subjects were screened for base variations by single-strand conformational polymorphism (SSCP) analysis of the amplified products of polymerase chain reaction(PCR). Those who were found have abnormal conformational band were sequenced. ResultsFive kinds of polymorphism were found in 15 cases of controls and six kinds of polymorphism in 10 patients. No mutation was found in Cx26 gene in Chinese with autosomal recessive NSHI. Heterozygous deletion AT at position 299-300 of Cx26 cDNA, which results in premature chain termination, was found in a pedigree with autosomal dominant hereditary nonsyndromic hearing loss. ConclusionThe prevalence of deafness-causing mutations in Cx26 gene in Chinese with autosomal recessive NSHI maybe is lower than that of other ethnic groups. Heterozygous deletion AT at position 299-300 of Cx26 cDNA can lead to autosomal dominant hereditary hearing loss (DFNA3).

【Key words】Connexins；Genes；Mutation；Deafness；Hereditary

遗传性聋分为综合征性耳聋（syndromic hearing impairment, SHI）和非综合征性耳聋（nonsyndromic hearing impairment, NSHI），有常染色体显性、常染色体隐性、X-连锁和线粒体突变母系遗传4种遗传方式。在新生儿中的发病率约为1/2 000，语前遗传性聋绝大部分属于NSHI，其中75%～80%为常染色体隐性遗传，20%～25%为常染色体显性遗传，1%～1.5%为X-连锁遗传；语后遗传性聋基本上属于常染色体显性遗传NSHI^［1］。Cx26(GJB2) 基因1993年被克隆，定位于13q11-12，互补DNA (complementary DNA，cDNA)全长2311 bp，编码区678 bp。1997年发现Cx26突变与常染色体显性遗传性聋DFNA3（OMIM 601544）和常染色体隐性遗传性聋DFNB1（OMIM 220290）有关^［2］。遗传性疾病基因诊断时需辨别DNA分子碱基改变是多态性(polymorphism)还是致病突变（mutation）。多态性是指人群中个体的DNA分子某些位点碱基发生了改变，但不改变基因的表达性状和功能，在单基因遗传病家系中，这种碱基改变在后代中不与遗传性状共伴随。当DNA分子中碱基的改变使基因的表达性状和功能发生变化，在单基因遗传病家系中，这种碱基改变在后代中与遗传性状共同出现（称为共分离，co-segregate）,则称为突变或致病突变（disease-causing mutation）。为评价中国非综合征性耳聋患者的Cx26基因突变频率和特性，我们对16例散发先天性聋哑儿童、39例常染色体隐性遗传性聋、30例常染色体显性遗传性聋患者进行了Cx26基因突变检测，现将结果报告如下。

对象与方法

一、对象

1．病例选择：全部对象为中国人。耳聋分级：语言频率平均听阈10～30 dB nHL，为轻度聋；30～60 dB nHL，为中度聋；60～ 90 dB nHL，为重度聋；90～120 dB nHL,为深度聋；大于120 dB nHL为全聋。选择以下3类耳聋患者：①散发先天性聋哑儿童16例，年龄1～10岁，其中男10例，女6例；听性脑干反应（auditory brainstem response, ABR）测试示130 dB peSPL刺激13例无诱发反应，3例可诱发出Ⅲ波和Ⅴ波；②常染色体隐性遗传感音神经性聋（家系中至少2例同类耳聋患者）39个家系中的先症者39例（男22例，女17例），年龄1.5～30岁；重度聋19例，深度聋17例，全聋3例；③常染色体显性遗传性聋均按DFNA3的临床表型^［3］选择10岁前开始听力下降的感音神经性聋患者，30个家系中的先症者30例（男17例，女13例），年龄6～34岁；中度聋14例，重度聋11例，深度聋4例，全聋1例。所有研究对象行纯音测听或ABR检查听力水平，耳科学检查排除其它致聋因素，如中耳炎、耳外伤、药物中毒性聋和梅尼埃病，并检查全身情况排除综合征性耳聋。抽外周静脉血10 ml，肝素抗凝无菌保存，72 h内抽提基因组DNA。在耳聋家系中，首先选择先症者筛查Cx26基因的碱基改变。

2．对照组：从医学遗传学国家重点实验室DNA库中随机挑选健康中国成人100例的人基因组DNA (gDNA)为对照组,年龄18～60岁,男70例,女30例,均接受听力、甲状腺、心、肺、肝、肾和神经系统检查。

二、方法

1．DNA制备：用酚-氯仿法抽提基因组DNA。DNA溶于三氨基甲烷-乙二胺四乙酸中，取适量用紫外分光光度计进行定量和纯度检测，其余于－70℃保存备用。

2．引物设计与合成：Cx26有2个外显子，编码区在第二外显子内，用Design PCR 软件设计包括编码区的3对引物，Cx26-1U/1L：5 ′tcttttccagagcaaaccgcc 3′/5 ′agatggggaagtagtgatcgta3 ′，退火温度 62 ℃，扩增片段长度246 bp；Cx26-2U/2L：5′ggctgcaagaacgtgtgctac3 ′/ 5 ′tacatgacatagaagacgtac3 ′，退火温度58 ℃ ，扩增片段长度299 bp；Cx26-3U / 3L: 5 ′caagcagcatcttcttccgggt3 ′/ 5 ′gggcaatgcgttaaactggc3 ′，退火温度58 ℃，扩增片段长度282 bp；在Beckman Oligo1000 DNA合成器中合成。这3对引物的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增产物覆盖了Cx26基因的全部编码区，可用于分析编码区内所有的碱基改变。

3．PCR扩增：通过PCR反应扩增待分析DNA靶序列的量。反应体系为20 μL，含1×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl₂ ，160 μmol dNTPs （MBI公司，美国），正反向引物各60 ng，Tag酶2 U(ABI公司，美国)，gDNA 100 ng。PCR反应在PE9600热循环仪上完成，反应条件为：96 ℃预变性2 min，95℃变性10 s，复性20 s，72 ℃延伸45 s，32个循环，反应终止后再72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。耳聋组每次设健康人gDNA为阳性对照和空白对照。取5 μL PCR产物行6%聚丙烯酰胺凝胶（29∶1）电泳检测产物的量和特异性，二者均满意者进行单链构象多态性（single strand conformational polymorphism analysis，SSCP）分析。

4．SSCP分析： PCR产物加等体积2×甲酰胺变性载样缓冲液，98 ℃变性10 min立即置冰上聚冷，上样于8%的SSCP胶（含5%的甘油，49∶1聚丙烯酰胺），恒电压300 V的4 ℃水循环恒温电泳约20 h。 剥胶银染，在GS700光密度扫描仪（Bio-Rad 公司，美国）上记录并打印扫描结果。PCR产物变性后单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单个碱基置换、或数个碱基插入或缺失等改变时迁移率变化，可区分变异DNA和非变异DNA，变异DNA电泳带称为异常构象带。发现异常构象带者再行DNA测序。

5．DNA测序：为证实SSCP分析所发现的异常构象带序列的碱基改变，对发现异常构象带者进一步行Cx26基因的DNA测序。引物1U和3L的扩增产物包含Cx26基因cDNA编码区全长，Cx26-1U和Cx26-3L分别作为正向和反向引物，用于扩增测序模板。捣碎浸泡法回收模板DNA，纯化，用ABI prism bigdye terminator cycle sequencing kit在 ABI 377 自动测序仪上以扩增模板的引物正反向测序。测序结果通过GCG（genetic computer group）软件进行分析。

结果

1． PCR-SSCP分析：分别发现对照组15例（15/100）、散发先天性聋哑患儿2例（2/16）、常染色体隐性遗传家系的先症者6例（6/39）、常染色体显性遗传家系的先症者3例（3/30）有异常构象带。在先症者发现异常构象带的家系中，进一步对全家系行PCR-SSCP分析，在1例常染色体显性遗传性聋家系中，先症者患耳聋的弟弟和儿子有与先证者相同的异常构象带，听力正常的父亲和配偶未见异常构象带，即该家系中Cx26基因异常构象带与<