【摘要】目的探讨母系遗传性非综合征性耳聋的听力学特征及分子遗传学机制。方法选择一遗传聋大家系中4代41人为研究对象, 详细询问病史和全身体格检查, 行系统听力学测试和线粒体DNA（mtDNA）A1555G突变分析。结果20例母系亲属均存在A1555G点突变；纯音测听17例呈程度不等的感音神经性聋,双耳对称,发病年龄1～50岁, 5例听力近11年间呈进行性下降；声导抗测试均为A型鼓室曲线,12耳可在低感觉级引出镫骨肌反射；听性脑干反应( auditory brainstem response，ABR)和瞬态诱发耳声发射测试无蜗后病变证据。21名父系亲属及配偶无听力障碍,mtDNA A1555G突变检测阴性。结论本家系以迟发性进行性耳蜗性聋为特点，导致听力损失的内在因素为mtDNA A1555G突变，而环境因素和核基因可能也参与了突变体mtDNA表型表达的调节。

Audiological findings and mitochondrial DNA mutation in a large family with matrilineal sensorineural hearing loss

XING Guangqian, BU Xingkuan, YAN Ming, et al.

(Department of Otorhinolaryngology, First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China)

Corresponding author: XING Guangqian

【Abstract】ObjectiveTo explore audiological features of matrilineal non-syndromic deafness and its molecular mechanism.MethodsA large family with 41 members having inherited deafness was studied. Complete history and the data of general and otolaryngological examinations were collected. All subjects were screened for mitochondrial DNA A1555G mutation by molecular analysis. Audiological evaluation included pure-tone audiometry, auditory brainstem responses and transiently evoked otoacoustic emissions.ResultsAll subjects were in good health generally. Molecular analysis showed that all maternal relatives with or without hearing loss harbored the A1555G mitochondrial mutation. No mutation was found among spouses and paternal relatives. Audiological results showed notable symmetric bilateral sensorineural hearing loss in 17 of 20 maternal relatives, in which 5 cases had a progressive hearing loss in the recent 11 years. The age of appearance of hearing loss ranged from 1 to 50 years.ConclusionAll hearing-impaired subjects of this family had late-onset sensorineural hearing loss. Most of which were progressive. The A1555G mitochondrial mutation in the 12S rRNA gene is responsible for the disorder. Other factors, such as nuclear genes or environmental determinants, may influence the clinical expression of mutant mtDNA.

【Key words】Hereditary diseases；Hearing loss,sensorineural；DNA, mitochondrial；DNA mutational analysis；Polymerase chain reaction

1987年我们在江苏省淮阴县发现一遗传聋大家系（6代507人），对其中4代386人进行了遗传学和听力学调查，确诊遗传聋患者137人^［1］。为进一步探讨该家系耳聋发生的分子遗传学机制，于1998年3月对其中一分支家系的4代41人进行了系谱复核和系统听力学测试，系谱分析表明该家系耳聋患者呈典型的母系遗传方式传递。同时应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)产物酶切及PCR产物克隆序列测定技术，对目前文献报道的与非综合征性母系遗传聋相关的mtDNA突变位点——12S rRNA基因的A1555G^［2］进行了研究，发现该家系中母系亲属均存在A1555G点突变，而家系配偶及男性个体的后代该突变检测阴性，提示mtDNA A1555G突变是该家系致聋的分子基础之一。

材料与方法

一、一般资料

该分支家系包括4代41人，其中直系亲属36人(母系亲属20人,父系亲属16人),配偶5人,遗传系谱见图1。母系亲属中原有15人于1987年曾接受过调查，调查内容包括纯音听阈测试和阈上功能检查、声导抗测试及听性脑干反应( auditory brainstem response，ABR)检测；另5人为近年来繁衍后代,属初查。对全体成员行详细病史询问和全身体格检查,尤其注意有无听力下降、眩晕、耳鸣及有无耳毒性药物和噪声接触史,如有听力损失,则详细记录发生年龄及进展情况。

图1耳聋核心家系图

二、mtDNA A1555G突变分析

1.DNA提取及模板mtDNA的扩增：全体成员各抽取外周静脉血5～10 ml，按酚/氯仿抽提法提取DNA。以mtDNA寡核苷酸(nt)1326～1335和(nt)1684～1704为引物，家系成员外周血白细胞粗提DNA为模板，扩增mtDNA (nt)1 326～1 704基因片段。PCR反应参数为：94℃ 4 min变性；94℃ 45 s,60℃ 45 s,72℃ 45 s,共35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳观察PCR反应结果。

2.PCR产物纯化和酶切：使用宝灵曼公司PCR产物纯化试剂盒，按使用说明操作，纯化PCR产物。取经纯化的1555位点PCR产物10 μL，加入限制性内切酶Alw26 I (MBI公司，德国)10 U，37℃酶切1 h，2%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

3.PCR产物克隆和序列测定：取PCR纯化产物1 μL,T4 DNA连接酶缓冲液1 μL,PEGM-T Vector 1 μL, DNA连接酶1 μL, 双蒸水（ddH₂O）6 μL,4℃连接24 h。常规法转化细菌DH5α，涂在含X-gal的LB固体培养基上，37℃培养。选取板上的白色菌落，重新划线培养。单菌落PCR检测，证实有插入片段的阳性克隆后，培养细菌，小制备碱法提取质粒。使用T7启动子引物，377全自动测序仪测序。

三、听力学检测

除1例2岁的母系亲属听阈由ABR测试结果确定外，全体成员行纯音听阈测试和声导抗测试。纯音听阈以0.5、1、2和4 kHz气导平均值计算,听力损失程度则根据WHO推荐草案^［3］确定,即:轻度26～40 dB HL,中度41～60 dB HL,重度61～80 dB HL,极重度≥81 dB HL。进行性听力下降定义为：1987年和本次测试0.5～4 kHz纯音听阈平均提高≥10 dB或其间任意2个频率提高≥15 dB。

对5例初查的母系亲属同时行ABR和瞬态诱发性耳声发射(transiently evoked otoacoustic emission，TEOAE)检查。ABR测试用RION ER-02型诱发电位仪,Ⅴ波反应阈≤30 dB nHL定为正常标准。TEOAE测试用Celesta 503声发射仪进行,刺激声为短声,强度为80 dB peSPL,脉宽80 μs,采用非线性(3+1)给声方式,叠加1 000次,扫描20 ms,延迟5 ms记录,以波形总相关系数r≥0.6为正常标准。

所有检查在符合要求的隔声室或隔声电磁屏蔽室中进行,仪器均经校准合格使用。

结果

一、一般资料

母系亲属中15例诉听力下降, 均为1987年接受过调查者，根据病史及听力检测结果综合判断其发病年龄为1～50岁。其中10例主诉听力损失进行性加重，5例近11年来继续恶化；4例伴高音调耳鸣；2例有一过性眩晕发作；6例曾应用常规剂量氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotics,AmAn),其中4例（Ⅰ6、Ⅱ11、Ⅲ1、Ⅲ2）在耳聋前3个月内用药,发病年龄1～3岁，另2例应用后原有听力损失急剧加重；2例2耳伴慢性化脓性中耳炎。父系亲属及配偶共21人,9人曾因各种原因接受过AmAn注射治疗。耳鼻咽喉及全身检查无异常。

二、mtDNA 1555位点突变检测结果

使用引物mtDNA (nt)1326-1335和(nt)1684-1704扩增家系中所有成员，均可见一379 bp扩增带。由于正常个体mtDNA 1555位点包含有限制性内切酶Alw26 I的切割识别位点GAGA¹⁵⁵⁵C，酶切后可见153 bp和226 bp两条带，当存在A1555G突变时该酶切位点消失，酶切后仅见379 bp一条带。本家系成员酶切结果表明，20例母系亲属均存在mtDNA A1555G突变，而家系中配偶和男性个体(包括男性患者)的后代A1555G突变阴性（图2）。

图2部分家系成员PCR产物酶切电泳图。M为标准物

对家系成员Ⅰ1、Ⅱ2、Ⅲ1、Ⅳ1 mtDNA 1555位点的测序结果表明，1555位点存在A→G点突变（H链，图3）,而配偶和男性后代的1555位碱基为正常的A（L链）。

图3mtDNA 1555位点测序结果（H链）

三、听力学检测结果

1.纯音测听：16名父系亲属和4名配偶纯音听阈均在正常范围,其中Ⅲ7 1987年(5岁时)曾根据ABR测试结果定为遗传性单耳聋,推测当时可能患有分泌性中耳炎或测试误差等所致。1名72岁配偶4～8 kHz有30～45 dB的双耳对称性感音神经性听力损失,在排除其它可能致聋原因后,考<