【摘要】目的了解喉返神经再生时N-乙酰胆碱受体(N-Acetylcholine receptor，N-AchR)的分布及含量改变。方法采用透射免疫电镜结合图像分析技术观察喉返神经再生过程中神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）及其N-AchR的超微结构。结果术后3周突触前膜结构基本消失而后膜结构尚完整，N-AchR含量较健侧增多，为健侧1.28倍。术后6周再生神经长入NMJ，但与突触后膜接触面积小, n-AchR含量处于最低状态，为健侧0.47倍。术后12周NMJ结构较前成熟，N-AchR含量增加为健侧0.72倍。术后18和24周神经末梢与突触后膜接触良好，N-AchR继续增多并趋稳定，分别为健侧0.83和0.81倍。结论提示周围神经再生时N-AchR含量与再生神经恢复程度有关。

The electron microscopic study of AchR and ultrastructure of neuromuscular junction in recurrent laryngeal nerve reinnervation

ZHENG Hongliang^*, ZHOU Shuimiao, YAN Yongbi, et al.

(Department of Otorhinolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Corresponding author：ZHENG Hongliang (Email: zhenghl@smmu.edu.cn)

【Abstract】ObjectiveThe purpose of this study was to observe the distribution of Acetylcholine receptor (AchR) and ultrastructural changes of the neuromuscular junction after laryngeal reinnervation. Methodsα-bungarotoxin-horseradish peroxidase (α-BT-HRP) conjugate electron microscopic immunocytochemical methods and computer analysis of intensity of immunocytochemical reaction were applied to observe the distribution and relative quantity of junctional N-AchR. ResultsThe results showed that the synaptic nerve terminals and presynaptic membrane were segmentally disrupted and almost disappeared completely and were replaced by Schwann's cells at 3 weeks after neurorrhaphy. At 6 weeks, some of the regenerating axons grew to the neuromuscular junctions and all the muscle fibers were reinnervated at 12 weeks. But the original postsynaptic membranes were only partially in contact with the regenerated nerve terminals. These conditions persisted until 18 weeks after neurorrhaphy, when remyelination was found in the vicinity of the neuromuscular junctions. The N-AchR reaction product on the postsynaptic membrane were increased greatly about 1.28 times more than the normal at 3 weeks after neurorrhaphy. The reactive products decreased greatly which was only 0.47% of that in the normal at 6 weeks. It remained low until 12 weeks after neurorrhaphy, which was 0.72% of the normal side. It increased obviously to 0.83 times of normal sides at 18 weeks and didn't changed there after. ConclusionThe state of reinnervation determines the quantity of neuromuscular junctional N-AchR.

【Key words】Nerve regeneration；Vocal cord paralysis；Acetylcholine receptor；Electron microscopy

神经再生时神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）的超微结构已有报道，有采用常规方法观察NMJ，但不能完全反映肌功能状态。有采用乙酰胆碱脂酶染色法显示, 但乙酰胆碱脂酶仅间接反映肌功能状态^［1］。有报道采用乙酰胆碱受体 (acetylcholine receptor，AchR) 结合法, 但其未区分功能状态与非功能状态的N-AchR^［2］。我们采用α-银环蛇毒素 (α-bungarotoxin α-BT) 与辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP) 显示功能状态的N-AchR, 采用透射电镜结合图像分析技术观察N-AchR的分布及定量改变。

材料与方法

一、实验动物

选健康成年杂种犬10只, 体重8.0～15.0 kg, 于第4气管环水平切断一侧喉返神经, 在手术显微镜下以9-0无创伤缝线作喉返神经端端缝合术, 术后3、6、12、18、24周后取材, 每时间亚组2只犬。

二、α-BT-HRP交联与N-AchR标记

以过碘酸盐氧化法将α-BT(Sigma，美国)与HRP(Sigma，美国)作交联, 再通过Sephadex G-100柱分离α-BT-HRP, 洗脱液分管收集, 合并峰管得α-BT-HRP交联物, 以免疫双扩散及二氨基联苯胺显色鉴定。 动物麻醉后分离暴露出双侧甲杓肌及环杓后肌, 分离出小束肌纤维, 以牙签棒维持其原来长度, 取肌纤维全长, 浸入含1×10^-7 mol/L α-BT-HRP结合物的Tyroid溶液中, 置37℃吹氧培养3 h, 继之以二氨基联苯胺显色10 min。

三、N-AchR定位、电镜观察

显色后的肌纤维在立体解剖显微镜下可见到被标记的NMJ, 将肌纤维束分离成单根纤维, 以1%锇酸作后固定, 采用平板倒扣法, Epon 812包埋, 半薄切片后观察到显色的N-AchR, 再次定位、包埋, 超薄切片H-800透射电镜观察。以图像分析系统(华东理工大学自动化研究所)随机对每样本10个不同的NMJ所定微区N-AchR作定量分析。每亚组4样本所得结果取平均值, 与健侧比较获各亚组N-AchR的恢复率,以t检验作统计分析。

四、对照实验

1．抑制对照：以α-BT替代α-BT-HRP结合物, α-BT浓度也为1×10^-7 mol/L, 其它操作步骤均同上述实验组。

2．HRP对照：除以含HRP的Tyroid溶液替代α-BT-HRP结合物外, 其它操作步骤均同上述实验组。

结果

一、α-BT-HRP交联及对照实验

结合物经琼脂糖免疫双扩散对马抗银环蛇毒素全血清呈明显的单一白色线条, 再与二氨基联苯胺反应后变成棕黄色线条。抑制对照试验仅显示单一白色线条； 以HRP代替α-BT-HRP, 显色反应呈阴性。表明α-BT-HRP结合物对N-AchR结合活性高、特异性强。

二、正常状态下N-AchR

光镜下见呈棕黄色花瓣状的阳性沉积物, 以细线条构成多种形态的泡状样或细长形中空图像,有的锚在肌膜上,有的在纤维边缘丘状隆起,如伪足伸入肌膜，红、白肌纤维清晰可瓣。电镜下见突触后膜有电子致密度高的N-AchR免疫活性沉积物, 沉积物基本连续, 初级突触间隙及次级突触间隙处的密度均较一致。神经末梢各结构如突触前膜、线粒体、突触小泡均不着色, 突触小泡密集, 突触裂形态一致(图1)。

图1正常状态神经肌肉接头及AchR超微结构。突触后膜N-AchR免疫活性沉积物电子致密度高,基本连续。电镜×6 000

三、神经再生中NMJ及N-AchR超微结构

1．术后3周：神经末梢几乎完全消失, 代之以雪旺细胞, 残存的神经末梢也严重破坏, 突触前膜基本上消失, 突触后膜高低不平, 次级突触裂隙宽狭不均, 突触皱襞轻度紊乱, 但突触后结构尚完整。突触后膜N-AchR免疫反应沉积物增多, 平均为健侧的1.28倍，差异有显著性意义(P＜0.05)。

2．术后6周：再生神经纤维已有部分长入NMJ，但神经末梢小, 无髓鞘形成, 其与突触后膜接触面积小, 其内突触小泡稀少, 突触后膜变光滑, 初级、次级突触裂隙仍宽狭不一, 且NMJ处星卫细胞显著增多。突触后膜的次级突触裂皱襞N-AchR反应沉积物深浅不一,平均强度为健侧的0.47倍(图2), 显著低于健侧(P＜0.01)。

图2神经修复术后6周神经肌肉接头及AchR超微结构。突触后膜的次级突触裂皱襞N-AchR反应沉积物深浅不一。电镜×6 000

3．术后12周：再生神经大部分长入NMJ, 神经末梢增大, 与突触后膜接触面积增大, 其内突触小泡增多, 突触裂隙皱襞已趋均匀一致。但仍可观察到较多的卫星细胞增生。突触后膜N-AchR免疫活性物质分布较前均匀, 活性强度平均为健侧的0.72倍(图3), 虽显著低于健侧(P＜0.01), 但比6周强, 差异有显著性意义(P＜0.05)。

图3神经修复术后12周神经肌肉接头及AchR超微结构。突触后膜N-AchR免疫活性物质分布较前均匀。电镜×12 000

4．术后18及24周：术后18周再生神经纤维全部长入NMJ中, 神经末梢与突触后膜具有良好的接触, 其内突触小泡丰富, 次级突触裂隙及皱襞结构较成熟, 卫星细胞增生不明显。突触后膜N-AchR免疫活性物质继续增多, 平均为健侧的0.83倍(图4), 与术后12周相比, 差异有显著性意义(P＜0.05)。 但仍低于健侧, 差异显著(P＜0.05)。 术后24周神经末梢结构与术后18周无明显区别，N-AchR免疫活性物质平均为健侧的0.81倍, 与术后18周