摘要：目的了解抗原免疫对热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）在豚鼠耳蜗中表达的影响。方法以同种异体内耳组织为抗原免疫豚鼠，用免疫组织化学方法检测豚鼠耳蜗中HSP70的表达并进行计算机图像处理；对豚鼠膜迷路组织进行免疫转印分析以测定HSP71；以纯化的人类重组HSP71为抗原，用免疫转印技术(Western blot)检测动物血浆中HSP71抗体。结果HSP70在正常豚鼠耳蜗中呈低水平表达。抗原免疫后，实验组动物耳蜗HSP70免疫活性较对照组明显增强，两组间的吸光度值差异有显著性 (P＜0.01)；免疫后大多数动物（12/20）体内产生了抗HSP71抗体，实验组HSP71抗体阳性率显著高于对照组（P＜0.01）。结论同种膜迷路组织作为抗原免疫豚鼠能够诱导HSP70在耳蜗内合成增加；表明HSP70与自身免疫性内耳病有一定联系。

The role of heat shock protein 70 and its autoantibody in experimental autoimmune inner ear disease

WANG Pengju

(Department of Otorhinolaryngology, Center Hospital of Xiangfan, Hubei 441021，China)

WU ZhanyuanXIAO Baikui

Abstract：ObjectiveTo examine the effect of antigen stimulation on induction of the heat shock protein 70(HSP70) in the guinea pig cochlea and to explore the role of HSP70 and its autoantibody in the pathogenesis and diagnosis of autoimmunize inner ear disease (AIED).MethodsTo establish the animal model of AIED, homologous crude inner ear antigen was used to immunize the guinea pig. The expression of HSP70 was detected by immunocytochemistry and the relative staining densities were quantified with a light microscope image analysis system. The autoantibodies against HSP71 in the plasma of animals were tested by Western blot using purified recombinant human HSP71 as antigen.Results HSP70 presented in the normal guinea pig cochlea at a lower level. After immunological challenge, the levels of HSP70 immunoreactivity in the immunized animals were significantly increased as compared with control animals. Optical densities of cochleae of immunized animals were significantly greater than those of animals in the control group (P＜0.01). Most of the immunized animals had developed autoantibodies against HSP71.The incidence of autoantibody in the experimental group was significantly different (P＜0.01) from the control group.ConclusionAntigen stimulation could lead to an increase in the synthesis of HSP70 in the guinea pig cochlea. The detection of autoantibody against HSP71 might have significance in the diagnosis of AIED.

Key words：Heat shock proteins 70；Autoimmune diseases；Autoantibodies；Labyrinth▲

近年来热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）与自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease，AIED）之间关系已成为研究的热点之一^［1，2］。本研究以同种异体内耳组织为抗原免疫豚鼠，用免疫组化技术检测HSP70在豚鼠耳蜗中的表达，了解耳蜗组织细胞在抗原刺激下是否存在热休克反应，并以人类重组HSP71为抗原，用免疫转印技术(Western blot) 检测动物血浆中HSP71抗体的存在。

材料与方法

一、实验动物

选用耳廓反射正常、体重在250～400 g的健康花斑豚鼠，雌雄兼用(卫生部武汉生物制品研究所提供)，共30只，随机分为实验组20只和对照组10只。分笼后适应性喂养1周。

二、抗原的制备

豚鼠60只，断头，取出听泡，分离全膜迷路。匀浆、破碎，反复冻融4次(-70 ℃～37 ℃)，以2 500 r/min 离心10 min，取上清液在UV-265 型紫外分光光度计下测蛋白含量，将蛋白质的含量调到800 μg/ml。

三、免疫方法

按杨湘宁等^［3］方法进行，共免疫4次。实验组前两次免疫剂量各为800 μg/ml的抗原0.5 ml+0.5 ml完全弗氏佐剂，后两次免疫剂量各为400 μg/ml的抗原0.5 ml +0.5 ml不完全弗氏佐剂。对照组在相应时间及相应部位于前后两次分别注射等量的完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。动物在第4次免疫后2周处死， 处死前心脏穿刺采血，肝素抗凝，取血浆做免疫学指标检测。

四、检测指标

1. 听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）测试：动物于免疫前及处死前麻醉后在静电屏蔽室内行双侧ABR 测试。短声刺激，重复率为20次/s，扫描周期10 ms，滤波带宽100～3 000 Hz，信号叠加1 000次，以ABR波Ⅲ反应阈为标准判断听阈。

2. 豚鼠耳蜗HSP70表达：动物麻醉后开胸，灌注、固定后取出听泡，开放前庭窗和圆窗。固定、脱钙、包埋，中轴切片，覆片。滴加3%过氧化氢，滴加正常血清封闭液，加入一抗：1∶1 000鼠抗人HSP70，加生物素化羊抗小鼠IgG（即用型），滴加链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，二氨基联苯胺显色，蒸馏水冲洗终止反应，封片。为使HSP70相对含量定量化，在对照组、实验组双耳ABR阈提高≥10 dB组及ABR阈无提高组中各选4个耳蜗，在每个耳蜗的切片中随机抽取2张近中轴的切片做图像分析。用同济医科大学研制的HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图像免疫组化测量系统于400倍视野下测量Corti器和螺旋神经节细胞的吸光度。为减少误差，固定对每张切片第2、3回的以上部位的细胞进行吸光度测定。在每组中随机选择400个受检细胞做统计学处理，计算各组的平均吸光度值。用t检验(双样本等方差假设)分析各组平均吸光度值的差异。

3. 豚鼠膜迷路HSP71抗原的检测（Western blot）：取膜迷路抗原0.75 ml，加样品处理液，100℃水浴3～5 min。用微量加样器吸取样品蛋白，总量为100 μL。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，取下硝酸纤维素膜，切成6 mm宽的细条，置于孵育槽中。免疫识别具体步骤参考Sambrook等^［4］方法。一抗为1∶1 000兔抗人HSP71多克隆抗体（相对分子质量为71.2×10³，同济医科大学高温生理室制备），二抗为1∶1 000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（Sigma，美国），二氨基联苯胺显色，出现棕色条带为阳性。

4. 血浆HSP71抗体的测定：将人类HSP71的cDNA和pET载体连接，转染大肠杆菌，用β-异丙基硫吡喃半乳糖特异性诱导表达而得到纯化的人类重组HSP71（相对分子质量为71.2×10³）。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳转移至硝酸纤维素膜上，制成含HSP71抗原的硝酸纤维素膜小条（5 mm×2 mm），用含5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液封闭1 h。加入25 μL待测血浆（按1∶10、1∶20、1∶40用封闭液稀释）。具体步骤参考Wu等^［5］方法。二抗为1∶1 000的辣根过氧化物酶标记的羊抗豚鼠IgG（Sigma，美国），二氨基联苯胺显色，其阳性结果为硝酸纤维膜小条上明显的棕褐色带。

结果

1．ABR阈：末次免疫后2周实验组20只动物中ABR阈提高≥10 dB者共11只（15耳），其中4 只动物为双耳，7 只动物为单耳（4只左耳，3只右耳），其中反应阈升高10 dB有 5 耳，15 dB者 8耳，20 dB者1 耳，25 dB 者1耳，免疫前后平均反应阈（±s）为（12.12±3.74）dB和18.16±6.37) dB，差异有显著性（t=5.1962，P＜0.01）。对照组的平均反应阈在注射佐剂前后为（12.0±2.94）dB和（12.4±3.0） dB，差异无显著性（t=0.526 3，P＞0.05）。

2．HSP70在豚鼠耳蜗内表达：对照组豚鼠耳蜗内可见HSP70呈低水平表达，主要见于螺旋神经节细胞（图1）、Corti器（图2）；实验组螺旋神经节细胞、Corti器的内外毛细胞的HSP70免疫组化染色加深（图3，4）。各组的平均吸光度值为：对照组0.178 5±0.068 4（±s，下同）；实验组无ABR阈提高组0.215 2±0.116 7；双耳ABR阈提高≥10 dB组为0.315 6±0.128，统计分析表明，实验组和对照组平均吸光度值的差异有显著性（t=18.901 0，P＜0.01），实验组中双耳ABR阈提高≥10 dB动物和无ABR阈提高动物平均吸光度值差异也有显著性（t=11.683 3，P＜0.01）。

图1对照组耳蜗螺旋神经节细胞的HSP70的弱表达.SABC×200

图2对照组耳蜗Corti器HSP70的弱表达.SABC×400