【摘要】目的观察EB病毒(Epstin-Barr virus ，EBV)、抑癌基因P53、P16在鼻、鼻咽和扁桃体非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma ，NHL)中的表达，并分析其相互间关系。方法用原位分子杂交检测36例病变组织的EBV-DNA、P16mRNA，用免疫组化技术检测LMP1、P53及P16蛋白，5例原位杂交检测为EBV阴性的病例用原位PCR检测EBV-DNA。结果①23例(63.9%)检出EBV-DNA，11例(30.6%)检出 P16 mRNA；② 10例(27.8%) LMP1阳性，7例(19.4%)P53蛋白阳性，8例(22.2%)P16蛋白阳性；③T-NHL(16/19例)明显高于B-NHL(6/17例)的EBV-DNA阳性表达。结论鼻、鼻咽和扁桃体NHL尤其是T-NHL有较高比例的EBV感染，但未发现EBV感染与P53及P16表达之间有明显相关性。

EB virus infection and expression of P53 and P16 in non-Hodgkin's lymphoma

WU Lili,GU Guangyu,MA Dalie, et al. Department of Pathology,Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200433

【Abstract】ObjectiveTo observe the presence of Epstin-Barr virus(EBV) and expression of P53 and P16 in the non-Hodgkin's lymphoma(NHL) occurring in the nasal cavity and pharyngeal Waldeyer's ring.MethodsIn situ hybridization was used to detect EBV-DNA and P16-mRNA and immunohistochemical staining was used to examine the expression of LMP1,P53 and P16 in the 36 cases. Five cases whose EBV-DNA were negative at first assay by hybridization was re-detected for EBV-DNA by PCR.ResultsPositive expression rates of EBV-DNA, LMP1, P16mRNA, P53 and P16 were 63.9%, 27.8%, 30.6%, 19.4% and 22.2%. P53 and P16 expressions were not significantly different between T cell NHL and B cell NHL, nor were them significantly different between EBV positive and negative cases.ConclusionA higher percentage of EBV infection was detected in the nasal cavity and pharyngeal Waldeyer's ring in NHL. EBV infection was not significantly associated with P53 and P16 expresions in NHL.

【Key words】Lymphoma, non-Hodgkin's Genes, suppressor, tumor In situ hybridization Herpesvirus 4, human

鼻腔及咽淋巴环是头颈部结外非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma, NHL)最常见的部位，近年来研究表明，多种类型的恶性淋巴瘤中，存在着不同程度的EB病毒(Epstin-Barr virus ，EBV)感染，尤其在中线面部有较高的感染率，但EBV 在肿瘤发生中所起的作用仍不十分清楚。本研究收集鼻、鼻咽和扁桃体部位NHL 36例，从蛋白水平及分子水平对EBV 及P53、P16进行检测，旨在了解EBV的感染情况以及与抑癌基因之间的关系。

材料与方法

36例NHL包括T细胞型NHL19例（鼻腔15例，鼻咽3例，扁桃体1例），B细胞型NHL 17例（鼻腔3例，鼻咽8例，扁桃体6例），材料选自长海医院病理科1990～1997年活检石蜡标本。

1.免疫组化检测EBV潜伏膜蛋白(相对分子质量60 000 latent membrane protein, LMP1)、P53和P16蛋白： 36例均作 4 μm连续切片，用SP法进行免疫组化染色。所用抗体： LMP1系丹麦DAKO公司产品，抗P53单克隆抗体及抗P16多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。用EBV阳性鼻咽癌作阳性对照，用PBS代替一抗或用不加探针的杂交缓冲液代替探针作阴性对照。

2.原位分子杂交检测 EBV-DNA及P16mRNA：① EBV探针的制备及标记：合成引物一对，序列为5’-ACTTTAGAGGCGAATGGGCG-3’ 及5’-TGGCTGCTGTCTGGCTTACG-3’，用含有EBV片段的质粒DNA为模板，反应混合物中加入Dig-11-dUTP，PCR法合成探针并加以纯化；②P16探针的制备及标记：含P16片断的质粒由本室构建，由0.48 kb组成，经质粒提取及纯化、酶切鉴定及片断纯化后，用随机引物法标记P16基因探针(地高辛标记及检测试剂盒为德国宝灵曼公司产品)；③36例NHL均作原位分子杂交检测，方法及步骤按德国宝灵曼公司地高辛标记及检测试剂盒说明书进行。

3.原位PCR检测：选择5例原位分子杂交阴性的NHL切片，用原位PCR直接法检测EBV-DNA，显色方法同原位分子杂交。

结果

一、EBV抗原及基因组的表达以及与NHL表型的关系

1. 用免疫组化方法检测EBV潜伏膜蛋白抗原(LMP1)：10例(27.8％)阳性表达。阳性物质位于肿瘤细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒状(图1)。其中3例仅见少数散在细胞为阳性，用原位分子杂交检测上述3例，2例为阳性，1例为阴性。

图1肿瘤细胞胞浆LMP1阳性表达。SP×400

2. 用原位分子杂交检测EBV-DNA，22例(61.1%)阳性表达，阳性物质呈紫蓝色颗粒状，分布于胞核(图2)。

图2肿瘤细胞胞核EBV-DNA阳性表达。原位杂交×200

3. EBV基因组的表达及NHL表型的关系：16例T-NHL及6例B-NHL组织EBV-DNA阳性。经统计学检验（两个样本率的χ²检验)，T-NHL与B-NHL的EBV感染率差异有显著意义(χ²=6.21，0.01＜P＜0.05)。

4. LMP1免疫组化结果与EBV-DNA原位杂交结果的比较：免疫组化检测EBV LMP1阳性者10例中原位杂交阳性9例，阴性1例；免疫组化阴性者，原位杂交阳性13例，阴性13例。经统计学检验(配对计数资料的χ²检验),免疫组化检测LMP1与原位分子杂交检测EBV-DNA结果有显著相关。

二、P53蛋白的表达及其与NHL免疫表型的关系

用免疫组化方法检测P53，7例(19.4%)阳性表达，阳性物质位于胞核(图3)， 其中T-NHL阳性表达4例，B-NHL阳性表达3例。经统计学检验(两个样本率的χ²检验)，P53 蛋白在T-NHL与B-NHL中表达相差无显著意义(P＞0.05)。

图3肿瘤细胞胞核P53蛋白阳性表达。SP×400

三、P16 mRNA及其蛋白表达与NHL免疫表型的关系

用免疫组化方法检测P16，8例(22.2%)阳性表达，阳性物质位于胞浆(图4)。用原位杂交检测P16 mRNA,11例(30.6%)阳性表达，阳性物质主要位于细胞浆，少数位于细胞核(图5)。经统计学检验，T、B两组NHL组织P16 mRNA及P16蛋白表达差异无显著意义(P＞0.05)。

图4肿瘤细胞胞浆P16蛋白阳性表达。SP×200

图5肿瘤细胞胞浆及胞核P16mRMA阳性表达。原位杂交×200

四、EBV-DNA、P53 蛋白及P16mRNA表达之间的关系

EBV-DNA阳性者22例中，P53蛋白表达5例(22.7%)，P16mRMA表达7例(31.8%)；EBV-DNA阴性者14例中，P53蛋白阴性表达2例(14.3%)，P16 mRMA阴性表达4例(28.6%)。经统计学检验(两个样本率的χ²检验),EBV-DNA 表达阳性组及阴性组之间P53蛋白或P16mRNA的表达相差无显著意义(P＞0.05)。

五、原位PCR检测EBV-DNA

5例原位分子杂交EBV-DNA阴性的NHL切片，经原位PCR检测，结果1例阳性表达，阳性物质主要位于细胞核 (图6)。

图6肿瘤细胞胞核EBV-DNA阳性表达。原位PCR×400

讨论

一、EBV在NHL中的表达

文献报道EBV感染除与传染性单核细胞增多症、非洲Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤密切相关外，在各种类型NHL中也存在一定的感染率，多数检测结果显示：T-NHL EBV阳性检出率(61%左右)高于B-NHL(24%)；结外T-NHL的 EBV阳性检出率(60%～80%)高于淋巴结T-NHL(35%～50%)，鼻腔NHL的EBV阳性检出率(80%～83%)高于咽淋巴环NHL(50%)^［1］。本实验结果也证明鼻、鼻咽和扁桃体部位NHL中EBV感染率较高(61.1%)，且T-NHL的EBV感染率（16/19例）明显高于B-NHL（6/17例）。LMP1抗体的检出率因受抗体来源、病理类型及固定方法等影响，文献报道有很大差异。本实验经统计学检测，免疫组化结果与原位分子杂交结果具有一致性，但用原位分子杂交或原位PCR检测EBV更具敏感性。

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