摘要目的提高声门上型喉癌颈部转移淋巴结微小转移灶的检出率。方法应用抗细胞角蛋白（cytokeratin,CK,AE1/AE3）单克隆抗体，LSAB免疫组化法对46例（50侧）常规临床病理颈部淋巴结阴性（pN₀）的颈深上淋巴结进行监测。结果11例患者的13枚淋巴结中发现微转移灶。结论免疫组化法对微灶转移的检测比临床常规病理检查更敏感，因此是一临床更有使用价值的检查方法。

Immunohistochemical evaluation of micrometastases to cervical lymph nodes in supraglottic cancer

YU Zhenkun,HAN Demin,FAN Erzhong,et al.

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Affiliated Beijing Tongren Hospital of Capital University of Medical Sciences, Beijing 100730

AbstractObjectiveSupraglottic carcinomas of larynx tends to metastasize to cervical lymph nodes. The regular pathological method of diagnosis is easy to have the micrometastasis missed, and serial-sectioning is too difficult be used in the regular pathological examinations. The aim of this study was to evaluate the value of immunohistochemical assay in the detection of micrometastasis.MethodsMonoclonal antibodies against cytokeratin (AE1/AE3) were used to detect the cervical lymph nodes of 46 cases (50 sides of neck) of supraglottic carcinoma with pathologically negative findings (pN₀). ResultsMicrometastases were identified in 13 lymph nodes of 11 cases .Conclusion It is suggested that the detection of lymph node micrometastases with immunohistochemical method is more sensitive than that of regular pathologic method. It is comparable to serial sectioning. Therefore, It is a valuable clinical method to detect the early lymph node metastasis.

Key wordsLaryngeal neoplasms Lymphatic metastasis Keratin Immunohistochemistry

声门上型喉癌易发生颈淋巴结转移，转移率由于检查方法不同文献报告在25％～50％之间^［1］，甚至更高。对临床触诊阴性（cN₀）而确有转移的诊断，虽然可通过现代影像技术（如CT、MRI、超声、PET等）提高了检出率，但到目前为止，尚没有一种办法对所有转移灶准确判定^［2］。

颈部淋巴结转移是影响患者预后的重要因素，也是指导术后综合治疗的重要指标。70年代中期，屠规益教授根据声门上区淋巴系统解剖和引流特点，设计了对临床阴性淋巴结的声门上癌术中一期颈上深淋巴结清扫术，术中快速冰冻病理检查再决定廓清方案的策略，使颈部复发率降至4％左右^［3］。但术中淋巴结的冰冻病理检查较常规病理检查准确率低，即使常规HE检查也常常对微灶转移难以判定^［4］。我们以抗细胞角蛋白（cytokeratin,CK）单克隆抗体为探针行免疫组化法对46例（50侧）声门上喉癌选择性上颈清扫的标本656枚淋巴结进行检测，以期为预后和术后综合治疗提供参考。

材料及方法

1．1995年1月～1997年12月北京同仁医院耳鼻咽喉-头颈外科共手术治疗声门上型喉癌102例，对临床N⁺患者行改良根治性或根治性颈清扫术，对临床N0患者行单侧或双侧选择性上颈清扫术。本研究选择其中46例（50侧）术后常规病理检查淋巴结转移阴性（pN₀）的存档淋巴结标本进行研究。声门上原发灶病理全部为鳞状细胞癌，所有患者术前未行任何放射治疗、化学治疗或颈部手术。男40例，女6例；年龄43～72岁（平均66岁）；T₂N₀M₀ 4例，T₃N₀M₀ 32例，T₄N₀M₀ 10例；原发中线的声门上型喉癌（会厌喉面）而施双上颈清4例，共计选择性颈清术50侧，淋巴结656枚。

2．对淋巴结原石蜡包埋组织行厚5 μm常规切片2张，1张行HE染色，1张行免疫组化染色。

3．免疫组化染色（LSAB法）试剂：抗CK单克隆抗体AE1/AE3（Zymed公司，美国），二抗、三抗试剂购于北京中山公司。方法按试剂操作说明进行。

4．判断标准：CK蛋白为上皮源组织细胞特异性抗原，定位于细胞膜和胞浆。CK阳性细胞为棕黄色，阴性细胞不着色；正常淋巴结内无上皮组织。CK标记细胞阳性，结合组织形态特点判定为转移。

结果

1．原发灶癌巢对AE1/AE3单克隆抗体均有强阳性染色，细胞浆、细胞膜呈棕黄色，胞核无着色。

2．淋巴结内淋巴细胞无着色，CK阳性细胞簇或单细胞在周围蓝色淋巴细胞背景衬托下容易被发现。

3．淋巴结内转移微灶多分布于被膜下窦、髓窦（图1，2）。

图1淋巴结边缘窦微小转移灶。LSAB×200图2淋巴结内已形成的微小转移灶。 ×150

4．50侧颈上深标本656枚淋巴结中，发现13枚淋巴结内有微灶转移，分布于11例患者中，其中2例患者1侧颈部有2枚淋巴结阳性。2枚淋巴结内发现较大转移灶，复查HE切片也能证实其转移（图3，4）；其它微灶转移HE切片无法判定。

图3淋巴结内微小转移灶。 HE ×150图4同一淋巴结内微小转移灶，LSAB ×150

5．免疫组化法对淋巴结转移的发现率在常规HE病理染色切片的基础上提高10.7％（11/102）。

讨论

声门上型喉癌由于其淋巴系统的特点，易发生颈淋巴结转移，其转移率在25％～50％之间。临床上对确诊阳性转移患者的处理，公认的行联合根治术，而对阴性患者的治疗却一直存在争论，争论的焦点在于术前不能对淋巴结的转移，特别是隐匿性转移作出准确判断。尽管国内外许多学者应用CT、MRI、超声、PET等高科技手段对触诊难以发现的转移灶进行了多种尝试，以不同诊断标准提高了阳性率。到目前为止，尚没有任何一种方法，能将尚未引起淋巴结形态结构改变的微灶转移辨认出来^［2］。

70年代中期，国内有学者在声门上型喉癌淋巴引流规律的基础上，术中一期将同侧颈上深淋巴结切除快速冰冻病理检查，根据有无转移决定是否行廓清术，取得了良好的治疗效果^［3］。但冰冻切片检查细胞肿胀明显，假阴性率高。常规的HE染色检查也很难将淋巴结内单细胞或细胞簇分辨出来^［4，5］。另有学者用连续切片法对颈淋巴结内转移癌进行研究，提高了转移癌的诊断率。该方法工作量太大，只适用于科研工作，而无法将其应用于常规的临床工作中^［2］。

我们应用抗CK单克隆抗体（AE1/AE3）对声门上喉癌颈上深淋巴结在常规切片检查阴性（pN₀）的基础上进行免疫组化染色，结果11/50发现了微灶转移，比常规病理检查的检出率高了10.7％（11/102），对常规检查无法辨认的淋巴结内单细胞或几个细胞簇的转移微灶进行了免疫组化标记，提高了转移淋巴结的诊断率。

单细胞或微灶转移是淋巴结发生转移的早期表现，淋巴结内转移的癌细胞或细胞簇多分布于淋巴结的被膜下窦或髓窦，提示癌细胞的转移多通过输入淋巴管顺淋巴引流方向转移至淋巴结的。

抗CK（AE1/AE3）单克隆抗体对上皮源组织和细胞染色特异，淋巴结内淋巴细胞和组织均无着色，在大量淋巴细胞背景衬托下，淋巴结内外源性上皮来源的癌细胞胞浆和包膜呈棕黄色，一目了然，克服了常规染色单纯依靠细胞形态特点确诊的缺陷。本组中2枚淋巴结在免疫组化发现微灶转移后再对照HE切片，亦能发现转移灶。

声门上区毛细淋巴管丰富，管腔宽大呈多层次排列；声门上区毛细淋巴管汇集成淋巴管后经甲状舌骨膜穿出喉外，循喉上神经和喉上动脉引流至颈内静脉上淋巴结（颈上深淋巴结）；对喉癌下咽癌颈转移淋巴结分布的研究也发现，颈深上淋巴结是喉癌下咽癌主要转移部位^［6］；因此，对该组淋巴结的检查，能较早地发现淋巴结的转移。

淋巴结内微灶转移虽是转移的较早阶段，但却说明癌细胞已发生扩散，是不良预后的重要指标。如何对这类患者进行综合治<