摘要目的探讨离体前庭毛细胞（vestibular hair cells,VHC）去极化时细胞内钙离子活动特征及内耳活性物质ATP对离体VHC内钙离子浓度的影响及其机制。方法采用酶孵育后机械分离法分离豚鼠壶腹嵴VHC，6 μmol/L钙荧光探针Fluo-3染色，利用激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy,LSCM）记录静息状态下、加入高K⁺液及不同浓度ATP时代表VHC内［Ca²⁺］i的荧光强度相对值的变化。结果细胞外有Ca²⁺存在时，75 mmol/L K⁺可引起所观察5个VHC内［Ca²⁺］i均升高，细胞体和皮板区的［Ca²⁺］i变化一致；在细胞外无Ca²⁺的情况下，所观察的5个VHC中，高K⁺并不能引起细胞内［Ca²⁺］i 升高。在细胞外存在Ca²⁺时，不同浓度(1.0 mmol/L, 0.1 mmol/L)ATP可引起绝大多数（18/19）VHC内［Ca²⁺］i迅速升高，达高峰后下降，恢复至静息时的水平；细胞外无Ca²⁺时，ATP仅引起极少数(1/10)VHC内［Ca²⁺］i升高；而对照组加入与ATP等体积的Hank液，不引起VHC内［Ca²⁺］i升高。结论高K⁺引起VHC去极化时细胞外Ca²⁺经电压依赖性钙通道流入细胞内，使细胞内［Ca²⁺］i升高；ATP可引起VHC内［Ca²⁺］i的升高，以细胞外Ca²⁺流入为主。

Intracellular calcium mobilization and effects of ATP on ampullate crista hair cells of the guinea pig

HAN Weiju, ZHANG Suzhen, JIANG Sichang, et al.

Department of Otorhinolaryngology, General Hospital of PLA, Beijing 100853

AbstractObjectiveTo further understand the intracellular calcium mobilization features of the isolated ampullate crista vestibular hair cells(VHCs) and ATP effects on intracellular free calcium concentration(［Ca²⁺］i) in VHCs of the guinea pig.MethodsVestibular hair cells were isolated from the guinea pig crista ampullaris by enzymatic and mechanical methods. The influence of high K⁺ solution and ATP on ［Ca²⁺］i was investigated. The ［Ca²⁺］i of VHC was examined using laser scanning confocal microscopy(LSCM) and the Ca²⁺sensitive dye Fluo-3.Results (1) 75 mmol/L K⁺ Hank's solution resulted in an increase of ［Ca²⁺］i in both the cytoplasm and the cuticular plate of 5 type I VHCs. In the Ca²⁺-free medium, however, 75 mmol/L K⁺ solution could not induce ［Ca²⁺］i an increase in observed 5 type I VHCs. (2) In the presence of 1.0 mmol/L or 0.1 mmol/L of ATP, there was a rapid reversible rise of the ［Ca²⁺］i in 18/19 type I VHCs. A small response of ATP-induced ［Ca²⁺］i was found only in 1/10 of type I VHC in Ca²⁺-free medium. There was no significant increase in ［Ca²⁺］i when the same volume of Hank′s solution was applied to the chamber containing VHCs.Conclusions The result suggests that high K⁺ solution led to Ca²⁺ influx via voltage-dependent calcium channels. Extracellular Ca²⁺ influx is a major source of the ATP-induced ［Ca²⁺］i increase.

Key wordsHair cells, vestibuleCalciumAdenosine triphosphateMicroscopy, confocal

Ca²⁺作为细胞内第二信使，起着调控细胞反应的重要作用。钙与内耳毛细胞功能的维持、声电转换、内耳的频率选择性、基底膜振动的非对称性及非线性响应、传出神经对内耳的调控等都有密切关系。因此，研究内耳毛细胞的［Ca²⁺］i及其变化对探讨内耳的生理具有重要意义。高钾引起离体耳蜗毛细胞去极化时，可引起细胞内［Ca²⁺］i 显著升高^［1］。ATP可引起外毛细胞内［Ca²⁺］i 的升高,ATP可能作为耳蜗活性物质或传出神经递质起作用^［2］ 。本研究用钙敏荧光染料与激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)技术，记录静息状态、高钾引起去极化及加入ATP后离体前庭毛细胞(vestibular hair cells,VHC)内［Ca²⁺］i 的空间及时间分布特征，以探讨离体VHC内钙离子活动及ATP对前庭毛细胞［Ca²⁺］i 的影响及机理。

材料和方法

一、细胞分离与荧光着色

选用耳廓反射正常，体重200～250 g的健康花色豚鼠22只，雌雄兼用。快速断头，取出双侧听泡放入Hank液中，采用酶孵育后机械分离法^［3］，解剖显微镜下分离壶腹嵴，0.25 g/L胶原酶Ⅳ(Sigma公司，美国)室温下(22～24 ℃)作用20 min，将壶腹嵴移入经刀豆球蛋白(Sigma公司，美国)处理过的装有Hank液的培养皿中，剪碎，机械吹打分离，制备较多的VHC。6 μmol/L的 Fluo-3(molecular probe)室温下染色40 min。用Hank液浸洗3次，相差显微镜下选取活性良好的VHC，进行实验观察。

二、荧光信号的记录

经Fluo-3染色的活性良好的VHC内［Ca²⁺］i改变时，VHC的荧光强度相对值(各个时间点的荧光强度与初始荧光强度的比值)即发生改变，用Ultima型LSCM(Meridian公司，美国)可记录到不同时间和空间VHC的荧光强度相对值，未经校正时虽不能得到［Ca²⁺］i的绝对值，但通过记录荧光强度相对值的变化，可观察到VHC内Ca²⁺的空间分布及加药后VHC内［Ca²⁺］i的变化幅度。根据加药后反应的快慢，每隔2～5 s扫描记录一次荧光图像。观察记录静息状态下Ca²⁺的空间分布特征及加入高钾Hank液、ATP后随时间的动态变化，利用LSCM所配备的计算与图像软件，计算并绘制荧光强度相对值在加药前后随时间的动态变化曲线。

三、加药方法

相差显微镜下选取附壁良好且活性良好的Ⅰ型VHC，培养皿中原有Hank液1 ml,用微量加样器依所需浓度加入一定体积的实验药液，依药物扩散稀释，持续作用于细胞。观察高钾对VHC内［Ca²⁺］i 的影响时，加入150 mmol/L的高钾Hank液，K⁺最终浓度为75 mmol/L。为观察细胞外有钙与无钙2种情况下ATP的作用，实验分3组：有Ca²⁺组和对照组，细胞外液用Hank液；无Ca²⁺组，细胞外液用D-Hank液；实验组加入ATP-Na₂溶液(Sigma公司，用Hank液配制，pH调至7.4)；对照组加入与实验组相同体积的Hank液；各组加药方法相同。实验组依加药的体积计算ATP的最终浓度。

四、溶液

细胞孵育液用Hank液，三蒸水配制，主要盐浓度为(单位：mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.4，CaCl₂ 1.3，MgSO₄ 0.8，Na₂HPO₄ 0.4，KH₂PO₄ 0.4，D-葡萄糖5.5。用1 mmol/L NaOH调节pH至7.4。然后用全自动冰点渗透压计(上海第一医科大学)测量和1.0 mmol/L NaCl调节渗透浓度至(300±2) Osmmol/L。

D-Hank液：在Hank液成分基础上，去掉CaCl₂，MgSO₄。

高钾Hank液：KCl 150 mmol/L, NaCl 5 mmol/L, 其它成分及配制方法同Hank液。

ATP溶液：ATP-Na₂用三蒸水配制成0.1 mol/L的贮备液，用0.1 mmol/L的NaOH调pH值至7.0，低温保存。实验前用Hank液稀释至所需浓度，pH调至7.4。

A23187(一种钙离子载体，购自Sigma公司)与MnCl₂均用三蒸水配制。

结果

一、钙离子载体及Mn²⁺对离体VHC内［Ca²⁺］i的影响

向离体前庭毛细胞培养皿中加入1 μmol/L的钙离子载体(Ionophore) A23187后，代表细胞内［Ca²⁺］i的荧光强度相对值迅速升高，20 s内达高峰，并保持在较高水平，之后加入2 mmol/L的MnCl₂，其荧光强度相对值逐渐下降，最后降至低于静息时的水平（图1）。以上变化符合A23187及MnCl₂的药理特性^［1，4］，证明分离的毛细胞活性良好，测钙方法可靠。

二、高钾引起VHC去极化时［Ca²⁺］i 变化

图11 μmol/L A23187引起VHC内［Ca²⁺］i显著升高，并保持在高峰值；加入2 mmol/L MnCl₂后逐渐下降，至低于静息时的水平

向离体前庭毛细胞培养皿中加入高钾Hank液，K⁺最终浓度75 mmol/L，细胞内［Ca²⁺］i 在30 s内迅速升高，并保持在较高水平，无下降趋势。图2显示一个I型VHC在高K⁺ Hank液中细胞内荧光强度相对值