摘要目的探讨水杨酸钠对豚鼠单离外毛细胞(outer hair cell，OHC)钾电流(potassium current，I_K)、静息电位(resting potential，RP)和膜电容(membrane electric capacitance，MEC)的影响，分析水杨酸钠影响毛细胞功能的细胞电生理机制。方法应用膜片钳全细胞记录技术，测试0.1和1.0 mmol/L水杨酸钠用药前后OHC的I_K、RP和MEC变化。结果水杨酸钠对I_K的影响具有时效和量效关系，即用药后有I_K先增加后降低的双相作用，而高浓度水杨酸钠无论是对I_K的增加作用还是降低作用都比低浓度时明显。RP平均约为-60 mV，MEC平均约为39 pF。水杨酸钠有降低RP和MEC的作用，且均存在着量效关系，即高浓度时的作用大于低浓度时。水杨酸钠对RP和MEC影响的时效关系不明显。结论水杨酸钠具有影响OHC两侧膜的K⁺电导和细胞内外K⁺分布的作用，并通过对I_K、RP和MEC的影响改变OHC的兴奋性和机械活动特性，可能是水杨酸影响毛细胞功能的耳蜗机制之一。

Effects of sodium salicylate on outward potassium current, resting potential and membrane electric capacitance of the outer hair cell isolated from guinea pig cochlea

LIANG Yong, ZHONG Naichuan.

department of Otorhinolaryngology, Union Hospital, Tongji Medical University, wuhan 430022

AbstractObjectivesTo study effects of sodium salicylate on the outward potassium current (I_K), resting potential (RP) and membrane electric capacitance (MEC) of outer hair cells isolated from guinea pig cochleas and the cytoelectrophysiological mechanisms of effects of sodium salicylate on functions of hair cells.Methods Using the patch-clamp whole cell recording technique, I_K, RP and MEC were measured before and after the administration of sodium salicylate at concentration of 0.1 or 1.0 mmol/L. The effects of sodium salicylate on I_K, rP and MEC were observed.Results The effects of sodium salicylate on I_K had time- and dosage-effect relations, of which the former meant I_K increasing and then decreasing after administration, the later meant that the effects of sodium salicylate being much more dominant during either increasing or decreasing I_K in higher concentration than in lower concentration. The mean RP was approximately -60mV and the mean MEC was approximately 39 pF. Sodium salicylate could decrease RP and MEC, which possessed a dosage-effect relation, that is, the effect was stronger in higher concentration than in lower concentration, and there was no clear evidence for time-effect relation. Conclusions The sodium salicylate might affect the K⁺ conduction at the lateral membrane and internal and external distribution of K⁺ in the outer hair cell. Sodium salicylate might affect the excitability and mechanical activity of the outer hair cell by means of affecting I_K, RP and MEC, which might be one of the cochlear mechanisms of the effects of sodium salicylate on the functions of hair cells.

Key wordsSodium salicylateMembrane potentialsHair cells, outerPotassium channelsOutward potassium currentMembrane electric capacitance

耳蜗毛细胞上的离子通道是细胞内外离子转运和离子电流形成的基础，钾通道和钾电流(potassium current，I_K)对毛细胞的频率调谐、静息电位和兴奋性等生理功能起重要作用。离子通道的活性、离子的通透性和细胞内外离子的分布决定了细胞的静息电位(resting potential，RP)，也称膜电位（membrane potential)，生理或非生理(如药物)刺激可改变膜两侧的电化学梯度，导致膜电位改变和跨膜电流形成，引起细胞兴奋性变化。膜电容(membrane electric capacitance，MEC)是细胞膜作为绝缘层将细胞内外导电液分隔开而具有的电容器特性，其电容量等于在膜电位下从膜一侧转移到另一侧的电荷量，并与细胞的表面积有关。外毛细胞(outer hair cell，OHC)受某些因素刺激发生运动时可伴随着体积和表面积等形状的改变^［1-3］，这种变化可引起MEC的变化，而MEC的变化与细胞的长度变化呈对应关系，因此膜电容测试可以反映OHC的运动特性及其与OHC电流变化的关系^［3］。

水杨酸具有导致可逆性耳聋和耳鸣的耳毒性，有人提出作用部位是在耳蜗，且可直接作用于OHC，影响毛细胞的K⁺、Ca²⁺、Cl^-电导，从而影响毛细胞的机电转换和机械特性等生理功能^［4］，这一作用有可能对OHC的RP和兴奋性乃至MEC和运动性产生影响。我们以水杨酸钠为实验药物，采用膜片钳全细胞记录技术观察了用药前后豚鼠单离OHC的I_K、RP和MEC的变化，以此探讨水杨酸钠对OHC生理功能影响的细胞电生理机制，亦为耳蜗性聋和耳鸣的发病机制研究提供依据。

材料与方法

一、毛细胞分离

健康杂色豚鼠，体重250～380 g，雌雄不限，耳廓反射灵敏。快速断头，取下颞骨，打开听泡，置于Hank液。显微镜下剥去骨性蜗壳，取下基底膜并置入含0.25 mg/ml木瓜蛋白酶的Hank液中，20℃消化10～12 min，再用无酶Hank液清洗2～3次。用含0.25 mg/ml牛血清白蛋白的Hank液孵育1～2 h。

二、溶液配制与药物

Hank细胞外液(单位：mmol/L)：NaCl 137.0，KCl 5.4，MgCl₂1.0，CaCl₂ 1.3，羟乙基哌嗪乙胺磺酸［N-(2-hydroxyethl)piperzine-N′-(2-ethanesulfonic acid), HEPES］5.0，葡萄糖5.0，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.3，以95%O₂+5%CO₂混合气体充气至饱和。

细胞内液(电极内液，单位：mmol/L)：K-aspartate 85.0，KCl 45.0，Na-pyravate5.0，MgCl₂ 4.0，乙二醇乙二胺四醋酸［ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-teraacetic acid, EGTA］ 10.0，HEPES 10.0，K₂-ATP5.0，葡萄糖11.0，用1.0 mol/L KOH调pH至7.3。

水杨酸钠(Sigma公司，美国)用蒸馏水配成0.01 mol/L溶液备用。

三、微电极准备

取经预处理后的微电极玻璃毛坯(直径1.6 mm)，以二步法拉制后抛光，使电极尖端电阻为3～5 mΩ。充灌电极内液并固定于操纵器的固定杆上。

四、全细胞记录

1．细胞封接：取数滴细胞混悬液滴于置于倒置显微镜载物台上的多槽玻片上，高倍镜下选定形态和活性正常的OHC，将电极末端调入槽液中，补偿液接电位至零。在显微镜直视下，用微操纵器小心调节电极末端与细胞表面轻轻接触后，施以负压，使之与细胞膜形成高达10 gΩ以上的高阻封接。再施以负压吸破细胞膜，与细胞外近似绝缘，形成全细胞记录状态。根据需要对串联电阻和电容进行补偿。

2．记录仪器、条件和参数：仪器为PC-Ⅱ型膜片钳放大器(华中理工大学)。全部记录在屏蔽防震工作台上进行，室温20～30℃。

I_K：钳制电位为－70 mV。指令电压刺激：每秒给予一100 ms的阶梯式脉冲指令电压刺激，从－40 mV开始，以10 mV为一档逐渐升至+60 mV。为抑制钠电流，在每次指令电压刺激前先施一100 ms的－50 mV钳制电压。

RP：将电流钳制至零，在无电压刺激下记录膜两侧的电位差，即RP。

MEC：钳制电位为0，将快电容补偿调至零位，在2个连续的25 ms中分别给予－10和+10 mV的微弱电压刺激，利用相位敏感法由内设程序计算MEC。

3. 记录内容：于用药前和用药后(给药浓度为0.1和1.0 mmol/L)3、10和20 min分别作以下记录：①各指令电压下的I_K电流峰值、绘出I_K的电流-电压相关曲线，计算量效和时效关系；②RP；③MEC。

4．数据处理与分析：所有数据均在计算机显示、储存和读取，并以±s表示，配对t检验作统计学处理，比较和分析用药前后数据的变化及特点。

结果

一、毛细胞分离

一般情况下，每侧耳可分离出形态和活性正常的单离毛细胞约40～120个，毛细胞形态和活性正常的判别标准参照苏振伦等^［5］报道的方法。

二、水杨酸钠对I_K的影响

图1a、b分别为0.1和1.0 mmol/L水杨酸钠在用药前和用药3、10和20 min后的I_K记录结果及其电流-电压相关曲线。I_K在加药3 min后增加，10 min后开始降低，20 min时降低更为明显