【摘要】目的检测雌激素受体在鼻息肉肥大细胞和CD₄⁺、CD₈⁺ 及CD₆₈⁺细胞上的表达。方法采用抗肥大细胞，抗CD₄⁺、CD₈⁺、CD₆₈⁺细胞以及抗雌激素受体的单克隆抗体对9例鼻息肉标本进行免疫组化及双标免疫染色。结果所有上述细胞亚群均可被相应抗体清晰地检测到。形态学观察，雌激素受体阳性细胞明显与CD₄⁺、CD₈⁺、CD₆₈⁺细胞不同，但与肥大细胞相似；双标免疫染色，只有肥大细胞而非CD₄⁺、CD₈⁺、CD₆₈⁺细胞与雌激素受体阳性细胞的位置相吻合。结论鼻息肉中肥大细胞表达雌激素受体。这一结果将对揭示呼吸道变态反应和炎性疾病的病理以及雌激素参与炎性反应性疾病的机制将有理论和实用价值。

Expression of estradiol receptors in mast cells of the upper airway

ZHAO Xiujie, DONG Zhen, YANG Zhanquan, et al.Department of ENT & Head-Neck Surgery, Third Teaching Hospital, Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031

【Abstract】ObjectiveTo examine the expression of estrogen receptors in mast cells,CD₄⁺, CD₈⁺ and CD₆₈⁺ cells in human nasal polyps.MethodsImmunohistochemical and dual immunostaining methods were used with mouse monoclonal antibodies against human estrogen receptors, a range of human immune cell types included CD₄⁺(helper T-cells), CD₈⁺ (suppressor/cytotoxic T-cells), CD₆₈⁺ (Macrophages) cells and mast cells.Results Coincident with the known features of human nasal polyps, all the immune/inflammatory cell types examined were clearly detected with corresponding monoclonal antibodies. The cells positive for estrogen receptor were morphologically similar to the mast cells but distinct from CD₄⁺, CD₈⁺ or CD₆₈⁺ cells. The cells stained for estrogen receptors by dual immunostaining coincided exactly with cells labeled as mast cells but differed from CD₄⁺, CD₈⁺ or CD₆₈⁺ cells.ConclusionEstrogen receptors express only in mast cells, but not in CD₄⁺, CD₈⁺ or CD₆₈⁺ cells in the human upper airway.

【Key words】Nasal polyps Mast cell Receptors,estrogen

临床上早已有报道，某些鼻炎或哮喘的女性患者其呼吸道症状随卵巢激素水平变化而变化。肌肉注射孕激素曾成功地防止了某些重症经前期哮喘。动物实验中，外源性雌激素促进实验性鼻超敏反应模型的早熟并诱导鼻粘膜腺体增生、血管扩张和组织水肿。肥大细胞是变态反应和炎性反应中的关键效应细胞，也是重要的调节细胞，在呼吸道炎症中起着重要的作用。Cocchiara等^［1］和Vliagoftis等^［2］分别报道雌二醇可增强抗IgE、C48/80(肥大细胞活化剂)以及P物质诱发的鼠腹膜肥大细胞释放组胺，并且雌激素的这种作用可被雌激素受体阻滞剂——他莫西分完全阻滞。对孕激素治疗敏感的荨麻疹患者腹腔肥大细胞释放组胺的能力呈剂量依赖关系被孕激素抑制^［3］。但人类呼吸道粘膜肥大细胞是否有雌激素受体（estradiol receptor，ER）存在尚未证实。因为呼吸道粘膜肥大细胞和其他部位组织中肥大细胞起源及某些生物学特性不同。

最近，我们发现人上呼吸道变态反应和炎性反应疾病──鼻息内中含有大量的雌激素受体阳性细胞，其形态、大小和组织分布颇与肥大细胞相似^［4］。本研究目的是鉴定鼻息肉中雌激素受体阳性细胞的性质，以揭示呼吸道变态反应和炎性反应性疾病的病理以及雌激素参与呼吸道炎性反应的机制。

材料及方法

一、组织标本

人鼻息肉组织标本来源于9例接受鼻息肉手术的患者，其中男6例，女3例，年龄25～73岁。每份标本均常规甲醛固定，石蜡包埋。

二、单克隆抗体

单克隆抗体包括：①AER311：人雌激素受体第495～595氨基酸（Sero Tec，英国）；②AA1：人肥大细胞胰酶（DAKO，丹麦）；③IF₆：人CD₄淋巴细胞（DAKO，丹麦）；④C8/144B：人CD₈淋巴细胞，（DAKO，丹麦）；⑤PG-M1：人单核巨噬细胞（DAKO，丹麦）。本研究所用单抗(皆为鼠源性)均以Tris缓冲液(tris buffered saline, TBS，pH7.4)稀释至工作浓度1∶100。

免疫组化显色采用ABC试剂盒(生物素-抗生物素DAB显色系统，Vector Lab，美国)。免疫荧光染色采用Texas Red-streptavidin(Amersham lnt，英国)结合ABC试剂盒中的二抗以及荧光标记的马抗鼠多克隆抗体(Amersham lnt，英国)。

三、 染色步骤

每1蜡块切片数张，厚度5 μm，置于预先以APES(3-Aminopropyl triethoxylilane)包被的载玻片上。经脱蜡和系列酒精梯度脱水及阻断内源性过氧化物酶后，TBS洗3次。以0.1%胰酶K 37℃水浴中消化20 min。TBS洗后滴加马血清保护30 min，移去多余的马血清，滴加单抗AA1以标识肥大细胞，IF₆以标识CD₄淋巴细胞，C8/144B以标识CD₈淋巴细胞以及PG-M1以标识单核巨噬细胞，室温下孵育过夜并经TBS洗后，进行免疫组化染色（程序如产品说明书）和荧光双标染色。双染方法：滴加生物素标记的马抗鼠IgG于上述处理的含有一抗的玻片上，室温下孵育1 h，TBS冲洗后，与Texas Red-streptavidin室温暗处共育0.5 h，TBS洗涤，染色经荧光显微镜下观察后，各切片分别滴加AER311以标识雌激素受体。阳性对照用TBS或马血清代替AER311。室温暗处孵育1h，TBS洗，滴加荧光素标记的马抗鼠IgG，暗处孵育0.5h，TBS洗3次，封片后置于暗处(4℃)，7 d内观察。 荧光镜下观察Texas Red信号时使用31005D605滤光片（Cahroma，英国)。双标ABC-DAB+荧光染色：切片按常规ABC-DAB染色法用相应抗体分别标识肥大细胞，CD₄⁺、 CD₈⁺ 及CD₆₈⁺ 细胞， 然后滴加AER311标识ER并以荧光显色。

四、 结果观察

用连续切片对ER⁺、 CD₄⁺、 CD₈⁺ 及CD₆₈⁺细胞及肥大细胞的数量和组织分布进行对比观察。每张切片选择5个含有最多阳性细胞的高倍视野进行计数，每份标本的阳性细胞数以平均阳性细胞数/高倍视野表示。

五、统计分析

结果以均值±标准差表示，ER⁺细胞与肥大细胞之间的相关性用Two-tailed pearson Bivariate相关分析处理(SPSS)，ER⁺与CD₄⁺、CD₈⁺、CD₆₈⁺和肥大细胞之间的比较用以成对t检验。P值＜0.05视为统计学有意义。

结果

一、免疫组化特征

ER⁺细胞为圆形或椭圆形，呈胞浆阳性、胞核阴性，并且胞浆中含有大量的棕褐色颗粒(图1)；CD₄或CD₈⁺细胞呈现典型的淋巴细胞特征(图2)；而CD₆₈⁺细胞则是不规则的，拖尾线状的巨噬细胞特征(图3)。从形态上，唯有肥大细胞(图4)与ER⁺细胞颇相似。

图1人鼻息肉石蜡切片。鼠抗人雌激素受体单克隆抗体免疫组化染色。ER⁺细胞呈圆形或椭圆形，胞浆阳性，胞核阴性，且胞浆中含有大量的棕褐色颗粒。a：×1 000； b：×100

图2人鼻息肉石蜡切片。鼠抗人CD₈⁺ T-淋巴细胞单可龙抗体免疫组化染色。CD₈⁺细胞呈典型的核多、浆少的淋巴细胞特征。 a：×1 000； b：×100

图3人鼻息肉石蜡切片。鼠抗人CD₆₈