【摘要】目的了解Ca²⁺-ATP酶在耳蜗活动位点及膜迷路积水后耳蜗Ca²⁺-ATP酶的变化。方法选成年健康、Preyer反射正常豚鼠14只，左耳装圆窗电极后阻塞内淋巴，经声反应阈(CAP阈值)证明膜迷路积水形成；右侧为对照耳。用枸橼酸铅细胞组化法测定Ca²⁺-ATP酶，在透射电镜下Ca²⁺-ATP酶以磷酸铅黑色颗粒显示。结果对照耳Ca²⁺-ATP酶活动部位在蜗管前庭膜内淋巴侧、内外毛细胞皮板及静纤毛、血管纹中间细胞指突膜等处；实验性膜迷路积水后，声反应阈提高，前庭膜、内外毛细胞等处之Ca²⁺-ATP酶颗粒明显减少。结论膜迷路积水后声反应阈提高，前庭膜、内外毛细胞等处Ca²⁺-ATP酶活性明显下降，两者呈负相关。

Changes of Ca²⁺-ATPase in the cochlea of guinea pig during labyrinthine hydropZHANG Suzhen, SUN Jianhe, ZHAO Chengjun,et al. Department of Otorhinolaryngology PLA General Hospital, Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo investigate the localization of Ca²⁺-ATPase (Ca²⁺ pump) in the cochlea and its change in labyrinthine hydrops.MethodsThe left endolymphatic sac was ablated to induce endolymphatic hydrops in fourteen healthy guinea pigs after the sliver ball electrode was placed on the round window. The Ca²⁺-ATPase was studied by the lead citrate reaction in the control and hydropic ears. The reaction product was lead phosphate particles as an expression of Ca²⁺-ATPase activity under the electron-microscope.ResultsThe Ca²⁺-ATPase activity was found mainly on the endolymphatic surface of the Reissner's membrane, the stereocilia and cuticular plate of inner and outer hair cells, as well as along the infolding plasma membrane of the strial intermediate cells.The Ca²⁺-ATPase activity was significantly decreased during endolymphatic hydrops in the above-mentioned locations.ConclusionThe response thresholds of filtered click were increased and the Ca²⁺-ATPase significantly decreased in the cochlea during labyrinthine hydrops. These results suggest that correlation exists between the CAP threshold and the activity of Ca²⁺-ATPase in the model of labyrinthine hydrops.

【Key words】Ca²⁺-transporting ATPase Endolymphatic hydrops Hair cells Histocytochemistry

钙作为第二信使在内耳毛细胞（hair cell，HC）的换能、调谐、基底膜的非线性响应等方面起重要作用。选择性微电极证明内淋巴钙离子浓度（［Ca²⁺］i）极低，外淋巴含钙量高，两者相差10～100倍^［1］，内淋巴低钙是维持听觉和平衡功能所必须，动物试验证明听觉受损或膜迷路积水后内淋巴［Ca²⁺］i升高^［2,3］，内淋巴Ca²⁺的输入输出机制尚有争议，Ca²⁺-ATP酶在内淋巴钙离子的转换过程中的作用尚不清楚。我们用细胞组化方法，确定Ca²⁺-ATP酶在内耳表达的部位及膜迷路积水后Ca²⁺-ATP酶的变化，为内耳疾病治疗提供理论参考。

材料和方法

1.听功能检查及内淋巴囊阻塞术：选听力敏感（Prcyer反射正常）的健康纯白豚鼠14只，全身麻醉下左圆窗龛处置慢性银球电极，用滤波短声测0.25～16 kHz各频率复合动作电位(compound action potential, CAP)反应阈，正常者按Kimura法^［4］行左内淋巴囊阻塞术，每只动物于术后1个月测手术耳的声反应阈(CAP阈值)。

2.内耳细胞组化处理及超薄切片：声反应证明积水形成^［5］后快速断头处死，取出双侧听泡，右侧为对照耳。分别将14侧积水耳与对照耳置于2％多聚甲醛、1％戊二醛、0.1 mol/L二甲胂酸钠（pH 7.4）配制的固定液内，解剖显微镜下剥去耳蜗骨壳，分回取出耳蜗侧壁血管纹、前庭膜及各回Corti器。将各组织块置固定液内，在0～4 ℃环境中固定50 min。0.1 mol/L二甲胂酸钠、0.25 mol/L蔗糖缓冲液（pH 7.4）充分漂洗，并在0～4 ℃下过夜。用Ando法^［6］显示Ca²⁺-ATP酶：组织块孵育液含有250 mmol/L甘氨酸氢氧化钾缓冲液，3 mmol/L ATP二钠盐，10 mmol/L CaCl₂，2 mmol/L柠檬酸铅，10 mmol/L左旋咪唑，最终pH 9.0。所有标本在20 ℃下孵育10 min，用0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液漂洗3次，1％四氧化锇在0～4 ℃下固定20 min。梯度酒精脱水，环氧树脂812浸透，平板定向包埋。因组织既小又薄，结构明确，不做半薄切片，修块后直接用Ultracut E4型切片机超薄切片，片厚60～70 nm。用LKB 2168型自动超薄切片染色机染色，在醋酸铀中50 min，在柠檬酸铅中5 min，染2次。日立H-600型透射电镜观察。

3. Ca²⁺-ATP酶活性部位判断：组化反应中ATP是提供能量的底物，Ca²⁺是激活剂，铅是俘获剂，反应产物是磷酸铅，磷酸铅在电镜下为黑色颗粒（简称铅粒）。铅粒存在之处即Ca²⁺-ATP酶活动部位。

4.统计学方法：内淋巴囊阻塞前、后自身CAP反应阈比较采用t检验，以±s代表均值及标准差，用概率P表示差异显著性。

结果

1.听功能检查结果：每只动物模型采用滤波短声测对照耳及实验耳膜迷路积水前、后各频率声反应阈，如图1所示，积水后各频率声反应阈均提高且达显著界值。

图114耳膜迷路积水前、后CAP阈值。经t检验，P＜0.05，有统计学差异

2.Ca²⁺-ATP酶在内耳表达：以铅粒多寡为序，最多之处为前庭膜朝向内淋巴侧上皮细胞顶膜及微绒毛，朝向外淋巴侧的间皮细胞表面无铅粒沉积；其次为内、外毛细胞的皮板、静纤毛两侧缘(图2，3)；再次为外毛细胞（outer hair cell, OHC)下2/3的底侧膜与Deiters细胞相邻处，OHC传出神经突触膜，突触间隙的铅粒多于传入神经。血管纹边缘细胞铅粒最少，但血管纹中间细胞指突膜表面有较多铅粒。

图2OHC皮板、静纤毛两侧缘均有黑色磷酸铅颗粒，是Ca²⁺-ATP酶活动部位。×12 000

图3IHC皮板、静纤毛两侧缘均有黑色磷酸铅颗粒沉积。×17 000

3.膜迷路积水后Ca²⁺-ATP酶活性显著下降，Reissner膜内淋巴侧黑色铅粒较对照耳明显减少（图4）；OHC头皮板、静纤毛处的铅粒、OHC下2/3与Deiters细胞相邻处铅粒亦明显减少（图5，6）。

图4对照耳(a)与积水耳(b)前庭膜内淋巴侧Ca²⁺-ATP酶比较。积水耳磷酸铅颗粒明显减少，代表该酶活性下降。↑：为Reissner膜内淋巴侧铅粒。×6 000

图5积水后OHC皮板、静纤毛磷酸铅颗粒明显减少。×10 000

图6对照耳(a)与积水耳(b)OHC底侧膜Ca²⁺-ATP酶活性比较，积水后磷酸铅颗粒明显减少。↑铅粒。a:×12 000；b:×10 000

讨论

ATP酶包括线粒体ATP酶、细胞膜ATP酶、肌球蛋白ATP酶3类，细胞膜ATP酶可被Na⁺/K⁺、Ca²⁺/Mg²⁺激活，故称内耳Na⁺/K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶。Na⁺/K⁺-ATP酶已有较多研究，Ca²⁺-ATP酶研究甚少，尤其是膜迷路积水后Ca²⁺-ATP酶活性变化的研究更少。该酶是细胞膜上一种蛋白质，利用ATP的能量为动力，逆Ca²⁺浓度主动运转Ca²⁺到细胞外，故人们称之为“钙泵”。Schatzman首先在红细胞膜上发现Ca²⁺-ATP酶，以后学者们在肾脏、脑垂体、视网膜、中耳粘膜及肌肉等处证明该酶的存在，Yoshihara等^［7］在耳蜗外侧壁及前庭部、Maurer等^［8］