【摘要】目的探讨细菌抗原和内耳抗原之间的联系及热休克反应对其抗原的影响。方法用抗哺乳类热休克蛋白（heat shock protein，hsp）70抗体识别绿脓杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷白杆菌抗原，进行免疫转印分析，测试正常豚鼠膜迷路中hsp70的表达水平。用肺炎克雷白杆菌制作急性中耳感染动物模型，观察细菌和内耳与哺乳类hsp70相关的蛋白表达水平动态变化。结果抗哺乳类hsp70单克隆抗体识别上述各种细菌抗原均非hsp70家族，正常豚鼠膜迷路表达hsp70水平极低。肺炎克雷白杆菌侵入中耳后，其自身出现热休克反应，表达hsp水平增高，用抗hsp70单抗识别的表位有分子量70 000和17 000的蛋白分子。分子量70 000蛋白表达水平为注射后3 d最高，17 000蛋白表达水平于注射后5 d最高。豚鼠中耳受肺炎克雷白杆菌感染后，急性期内耳主要表达hsp70蛋白和与之有相关表位的hsp31，70 000蛋白的表达水平明显低于31 000。结论细菌侵入机体后其自身发生热休克反应，机体内耳hsp表达水平也相对增高，这些存在共同表位的hsp的高表达为微生物感染诱发内耳自身免疫反应提供了物质基础。小分子hsp有可能参与内耳自身免疫损伤。

Heat shock response in experimental acute middle ear bacterial infectionZou Jing^*,Jiang Sichang,Zhou Yongqing, et al.^*Bethune International Peace Hospital,Shijiazhuang 050082

【Abstract】ObjectiveTo investigate the association between bacteria antigen and inner ear antigen and effects of stress on the expression spectrum and level of the antigen bearing hsp70 related epitope.Methods use monoclonal antibody against mammiferous hsp70 to recognize the related antigens of Bacillus pyocyaneus,Bacillus proteus,Bacillus coli,Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae with modified western blotting. The expression level of hsp70 in unstressed guinea pig inner ear was tested.An animal model of middle ear acute infection by Klebsiella pneumoniae was established. The dynamic changes of mammiferous hsp70 epitope related proteins were tested with modified western blotting.Results All the bacteria antigens recognized by anti-mammiferous hsp70 antibody were not of the hsp70 family and the expression level of hsp70 in normal guinea pig was extraordinarily low.Klebsiella pneumoniae expressed 70 000 dalton and 17 000 dalton hsp after its invasion into guinea pig middle ear. 70 000 dalton antigen expressed most intensely at 3rd day of invasion and then fell.17 000 dalton antigen was expressed most intensely at 5th day of invasion and then fell. The expression of 70 000 dalton hsp was much weaker than 31 000 dalton hsp at acute periods of middle ear infection.ConclusionsThe elevated expression of hsp both in bacteria and inner ear during middle ear acute infection provides material base for immune impairment on inner ear induced by bacterial infection.The low molecular weight hsp may be involved in the inner ear autoimmune impairment.

【Key words】Antigen bacterial Labyrinth Bacterial infections Heat-shock proteins Otitis media,suppurative

自身免疫性内耳病的发病机制与实验室诊断是当前该领域的研究热点，Harris等^［1］首先在该类患者血清中检出了能与牛膜迷路蛋白68 000分子结合的抗体，认为这是一种内耳特异的抗体。我们^［2］在拟诊为自身免疫性感音神经性听力减退的患者血清中检出了能与豚鼠膜迷路蛋白68 000分子结合的抗体，进一步表明在膜迷路蛋白68 000区带中可能含有与自身免疫性内耳病有关的抗原。Billings等^［3］提出该抗体为抗哺乳类热休克蛋白(heat shock protein，hsp)抗体，并指出该类患者可能因曾患化脓性中耳炎，细菌hsp经圆窗膜进入内耳诱导机体(尤其是内耳局部)产生抗hsp抗体，导致一系列内耳损伤。我们分析了哺乳类热休克蛋hsp70与中耳感染细菌抗原的联系及其在正常豚鼠膜迷路中的表达，并用肺炎克雷白杆菌制作中耳急性感染动物模型，观察细菌和动物内耳热休克反应。

材料与方法

一、材料及其来源

豚鼠：26只，体重300～400 kg，雄性，耳廓反射正常。由白求恩国际和平医院实验动物中心和河北医科大学实验动物学部动物科提供。

细菌：绿脓杆菌(产品号ATCC-27853)、变形杆菌(产品号49027)、大肠杆菌(产品号ATCC-25922)、金黄色葡萄球菌(产品号ATCC-25923)和肺炎克雷白杆菌(产品号26114-7)均购自北京中国生物制品鉴定所。

培养基：3.6%水解酪蛋白琼脂，为上海医学化验所试剂厂产品。

抗hsp70单抗：美国Santa Cruz 生化公司产品，编号为sc-24。

辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG：美国Jackson 免疫研究实验公司产品，编号为115-035-003。

硝酸纤维素膜：北京化工学校附属工厂产品。

其它各种通用试剂为进口分析纯或国产分析纯产品。

二、方法

1.细菌抗原的提取：采用3.6%水解酪蛋白琼脂培养基分别将上述各种细菌于37℃培养24h，每一种细菌培养6个平皿，收集后用冷生理盐水于4℃洗涤离心(5 000 r/min×10 min)，共3次。用含0.1 mol/L NaCl、0.001 mol/L EDTA、100 μg/ml苯甲基磺酰氟（PMS F）、0.01 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl）缓冲液(pH7.6)将沉淀的细菌混悬，缓冲液的用量分别为金黄色葡萄球菌1.2 ml、绿脓杆菌1.0 ml、变形杆菌1.0 ml、大肠杆菌1.0 ml、肺炎克雷白杆菌0.6 ml。充分混匀后加入等量的SDS-PAGE样品缓冲液，超声粉碎(200W、15s×3)，100℃水浴3 min，8 000 r/min离心10 min(4℃)，收集上清备用或于-20℃保存。

2.豚鼠膜迷路蛋白的制备：将10只豚鼠用冷生理盐水行活体灌注，参照文献^［4］报道方法提取膜迷路蛋白，其改进之处为在缓冲液中加入100 μg/ml PMSF。

3. 免疫转印：按照改良免疫转印法^［5］，用抗哺乳类hsp70单抗识别上述5种细菌抗原，并测试hsp70在豚鼠膜迷路中的表达。抗hsp70单抗的稀释度为1∶10 000，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG的稀释度为1∶2 000。反应结果用Eagle EyeTM Ⅱ型电泳图像分析系统进行分析。

上述所有标本重复分析4次。

4. 中耳急性细菌感染动物模型的制作：16只豚鼠分为A、B、C、D 4组，每组4只，用戊巴比妥钠腹腔注射（44 mg/kg）麻醉后，在无菌条件下每侧中耳各注射1×10⁸个/L的肺炎克雷白杆菌液100 μL，在清洁饲养条件下喂养，A、B、C、D 4组分别于注射后第24h和3、5、7d取材备检。

5. 细菌和内耳热休克反应测试：动物活体灌注后，取下听泡，每侧中耳用0.5 ml缓冲液冲洗，将双侧中耳冲洗液合并后于4℃下，10 000 r/min离心5 min，收集沉淀，重复洗涤离心1次。制备肺炎克雷白杆菌抗原和膜迷路蛋白同前，电转移印迹用丽春红染色后，扫描记录蛋白电泳同上，结果与免疫转印结果比较分析。检测hsp70相关产物的表达水平同前。

6. 豚鼠中耳粘膜病理观察：在体视镜下剥离上述肺克雷白杆菌感染豚鼠中耳粘膜，4%甲醛固定，石蜡包埋，切片行HE染色，光镜观察。

结果

接种当天，豚鼠精神略显萎靡、活动减少，大、小便及饮食无明显异常，耳廓反射正常，无走路摇摆现象。随后（7d内）精神、饮食下降，耳廓反射迟钝，但走路无摇摆现象。个别豚鼠不好活动，耳廓发黑。取材时见接种后24 h听泡略显粗糙、颜色发暗。打开听泡后在体视镜下见中耳粘膜明显充血、水肿、增厚，随后中耳渗出物越来越稠厚，为脓性，鼓膜红肿、充血，耳蜗骨壁略粗糙。HE染色，光镜下见中耳粘膜内有明显中性粒细胞浸润（图1）。

抗hsp70单克隆抗体识别各种细菌抗原均非hsp70家族，而是小hsp，其中以变形杆菌37 000(灰度值33749)、绿脓杆菌45 000 (灰度值16651)、金黄色葡萄球菌34 000(灰度值7052) 抗原反应最强，肺炎克雷白杆菌38 000(灰度值2203)和17 000(灰度值4485)抗原也可与之反应。大肠杆菌及健康豚鼠膜迷路表达hsp70水平极低，该单抗可与膜迷路小hsp(分子量31000，灰度值1154)反应，其强度高于hsp70（图2）。4次结果一致。

肺炎克雷白杆菌侵入中耳后，其自身出现热休克反应，hsp表达水平增高，用抗hsp70单抗识别的表位有70 000和17 000，在17 000 处出现2条带，7 d后变为1条。70 000表达水平在注射后3d最高（平均灰度值33178），随后下降；17000蛋白表达水平于注射后5d最高（平均灰度值53527，12倍于肺炎克雷白杆菌表达水平)，随后下降（图3，4）。

豚鼠中耳受肺炎克雷白杆菌感染后，内耳在急性期主要表达hsp70蛋白和与之有相关表位的hsp31，31 000处出现2条带。70 0