【摘要】目的研究神经活性物质对耳蜗外毛细胞内游离钙离子浓度（［Ca²⁺］i）的影响。方法应用显微荧光测钙技术检测豚鼠耳蜗离体外毛细胞［Ca²⁺］i在加入乙酰胆碱、ATP、碳酰胆碱之后的变化。结果在含钙的细胞外液中，乙酰胆碱、ATP和碳酰胆碱均可引起［Ca²⁺］i升高，幅度分别为(0.74±0.129) μmol/L(乙酰胆碱)，(0.65±0.11) μmol/L(ATP), (1.16±0.27) μmol/L(碳酰胆碱)；而细胞外液中无钙时，ATP仅可引起缓慢而小幅度(0.18±0.05) μmol/L的［Ca²⁺］i升高。结论同属胆碱能毒蕈碱受体激动剂的乙酰胆碱和碳酰胆碱可作用于受体，打开离子通道，使细胞外Ca²⁺进入细胞内，导致外毛细胞［Ca²⁺］i升高；细胞外液有Ca²⁺时，ATP引致的［Ca²⁺］i升高，可能是因为引发了内向的Ca²⁺流，细胞外液无Ca²⁺时，［Ca²⁺］i升高则可能源于细胞内钙库的释放。

Effects of neuroactive substances on intracellular free Ca²⁺ concentration in isolated outer hair cells of the guinea pig cochleaYang Jun^*,Wang Jibao, Wei Shunhui.^*Union Hospital，Tongji Medical University，Wuhan 430022

【Abstract】ObjectiveTo measure the effects of neuro-active substances on intracellular free Ca²⁺ concentration (［Ca²⁺］i）in isolated outer hair cells（OHCs）of the guinea pig cochlea.MethodsThe fura-2 microfluorimetry was used to measure changes of ［Ca²⁺］i in OHCs of the guinea pig cochlea after application of acetylcholine, ATP and carbacholine.Results Acetylcholine，ATP and carbacholine increased［Ca²⁺］i (acetylcholine: 0.74±0.12 μmol/L, ATP: 0.65±0.11 μmol/L, carbacholine: 1.16±0.27 μmol/L) in OHCs in the presence of extracellular Ca²⁺． In the absence of extracellular Ca²⁺，however，only ATP induced a gradual and small ［Ca²⁺］i elevation，whereas other substances did not.ConclusionAcetylcholine and carbacholine, the cholinergic mascarinic agonists, increased ［Ca²⁺］i in OHCs by acting at receptor-induced ion channel resulting in Ca²⁺ efflux. ATP-induced elevation of ［Ca²⁺］i without Ca²⁺ in extracellular medium is due to a release of Ca²⁺ from an intracellular reservoir.

【Key words】 Calcium Cochlea Hair cells,outer Acetylcholine Carbacholine ATP Fura-2

耳蜗毛细胞内游离钙离子浓度（［Ca²⁺］i）的改变与毛细胞的许多重要生理功能有密切的关系，如声电转换、耳蜗的频率选择性、基底膜振动的非对称性及非线性响应、传出神经对内耳功能的调控等，而一些神经递质和耳蜗内的活性物质对毛细胞的直接作用则是完成这些生理功能的条件之一。为研究耳蜗内神经活性物质对耳蜗外毛细胞内［Ca²⁺］i的影响,我们应用显微荧光测钙技术对离体豚鼠耳蜗外毛细胞的［Ca²⁺］i变化进行分析，报道如下。

材料和方法

一、细胞制备

选用250～300 g的健康杂色豚鼠15只，雌雄不限。快速将动物断头，取出双侧听泡，置入D-Hank液中，在解剖显微镜（Olympus, ×15）下，打开听泡，剔除蜗壳，离断蜗轴，然后将其放入0.25%的Ⅳ型胶原酶溶液（Sigma，美国，D-Hank液配制）中，在细胞培养箱中，37 ℃孵育15 min。完成消化后，用D-Hank液冲洗3次，将蜗轴移入含500μL改良Eagle培养基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM，Gibco，美国）或D-Hank液的Petri培养皿中，平皿的盖玻片上预先涂有多聚赖氨酸（Sigma，美国），用自制的细钢针钩下基底膜，应用吹打技术分离，制得细胞悬液。

二、Fura-2AM孵育

待分离的细胞贴壁后，加入2μmol/L的荧光离子探针Fura-2AM(molecular probes, Eugene，美国)，在细胞培养箱中37℃避光孵育30～50 min。孵育后用DMEM或D-Hank液冲洗3遍以终止孵育。

三、仪器与实验步骤

采用75W的氙光源（TIL Lphotonics，德国）作为荧光激发光源，该光源通过一可程控转角的光栅反射后，成为单色光源,通过计算机可以选择不同波长的单色光（380 nm或345 nm），经过一段光纤导入屏蔽罩，通过倒置荧光显微镜（Zeiss Axiovert 100，德国）的激发荧光通路，由分光镜反射后经Plan Neofluar 物镜聚光后照射贴附于盖玻片上的细胞上。当激发光波长为345 nm时，Fura-2的荧光强度随［Ca²⁺］i的升高而升高；激发光波长为380 nm时，Fura-2的荧光强度随［Ca²⁺］i的升高而降低。细胞内被激发出的荧光通过物镜、500 nm的带通滤光片和光阑进入光电倍增管。记录范围由光阑限制在直径为18 μm的圆圈内。光电倍增管的输出信号经10 kHz的频率采样由计算机（Apple Macintosh Quadra 650，美国）处理，使用Pulse软件中附加的x-Chart软件，由激发光波长为345 nm时Fura-2的荧光强度与激发光波长为380 nm时Fura-2的荧光强度比值的变化推算出［Ca²⁺］i的变化^［1］。

在倒置荧光显微镜下选择活性良好的经Fura-2AM孵育的单离外毛细胞，分别用微量加样器将乙酰胆碱、ATP、碳酰胆碱(Sigma，美国，均用D-Hank液配置）滴加到平皿中的所选细胞上方，观察外毛细胞的Fura-2荧光强度变化。每次加药前均用DMEM或D-Hank液换细胞外液。测钙试验均在室温下（25～30℃），分离细胞后3h内完成。

四、试验用溶液

将DMEM 作为有Ca²⁺组的Fura-2AM 的孵育液和细胞外液，D-Hank液作为无Ca²⁺组Fura-2AM 的孵育液和细胞外液，用1 mol/L KOH将溶液pH值调至7.4，渗透浓度为300 Osmmol/L。

结果

一、乙酰胆碱对外毛细胞［Ca²⁺］i的影响

DMEM为细胞外液时，100 μmol/L的乙酰胆碱（此为加药后平皿中乙酰胆碱的最终稀释浓度，以下同）作用于外毛细胞，［Ca²⁺］i迅速上升，幅度为(0.74±0.12) μmol/L（n=10），经4s回到静息水平（图1）。

图1在DMEM中100 μmol/L 乙酰胆碱对1个外毛细胞内［Ca²⁺］i的影响

D-Hank液作为细胞外液时，在所测的8个外毛细胞中，对100 μmol/L的乙酰胆碱均无反应。二、ATP对外毛细胞［Ca²⁺］i的影响

DMEM为细胞外液时，100 μmol/L 的ATP引 起 ［Ca²⁺］i立即升高，变化幅度为(0.65±0.11) μmol/L（n=10），达到峰值后，经8s回到静息水平（图2）。

图2在DMEM中100 μmol/L ATP对1个外毛细胞内［Ca²⁺］i的影响

当细胞外液为D-Hank's液时，100 μmol/L的ATP作用于外毛细胞，［Ca²⁺］i缓慢上升（约8s），幅度较外毛细胞在DMEM中时减小，为(0.18±0.05) μmol/L（n=10），约70s回到静息水平。三、碳酰胆碱对外毛细胞的［Ca²⁺］i的影响

碳酰胆碱(也译为卡巴胆碱)是胆碱能毒覃碱受体（M受体）激动剂，当细胞外液为DMEM时，100 μmol/L的碳酰胆碱作用于外毛细胞，［Ca²⁺］i迅速升高，幅度为(1.16±0.27)μmol/L（n=8），约6s回到静息水平（图3）。

图3在DMEM中100 μmol/L的碳酰胆碱对1个外毛细胞内［Ca²⁺］i的影响

讨论

耳蜗中存在哪些神经活性物质，包括传出神经纤维释放哪些递质，局部微环境中有哪些活性物质，以及它们作用于细胞后引起的效应，一直是近年来内耳生理学研究的热点之一。为研究耳蜗内乙酰胆碱、ATP、碳酰胆碱对外毛细胞内［Ca²⁺］i的影响，我们应用了显微荧光测钙技术。该技术采用Fura-2AM作为Ca²⁺的染色剂，Fura-2AM是Fura-2的乙酰氧基甲酯，不带电荷可穿透细胞膜，不能与离子结合，装载（loading）进入细胞内以后，被非特异性酯酶分解，转化为Fura-2，后者与胞内游离Ca²⁺结合，在特定波长光的激发下可发出荧光。

乙酰胆碱可能是耳蜗内最主要的传出神经递质。本实验显示，在含Ca²⁺的DMEM细胞外液中，在100 μmol/L乙酰胆碱的作用下，外毛细胞中［Ca²⁺］i升高。其机制可能是乙酰胆碱作用于位于外毛细胞底部的乙酰胆碱受体^［2］，引起