【摘要】目的应用分子生物学技术建立人类颞骨火棉胶切片中的DNA分析方法。方法采用多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)配合不同的引物、扩增方式及酶切技术检测长期保存的7例（9侧）颞骨火棉胶切片中微量线粒体DNA的片段缺失及点突变，pGEM-T载体进行扩增片段的重组与克隆。结果9侧颞骨DNA提取液中均可见正常的135bp扩增片段，巢式PCR检出其中2例生前患老年聋者（各查1侧）有线粒体DNA大片段缺失，测序结果证实扩增的准确性。结论分子生物学技术在颞骨切片研究中的应用对于提高其回顾性研究水平有重要意义，目前可在耳科疾病的研究中发现相关的基因突变或病原体。

Extraction, amplification, recombination and sequencing of the mitochondrial DNA from celloidin embedded human temporal bone sections Dai Pu, Jiang Sichang, Yang Weiyan, et al. PLA General Hospital, Beijing 100853

【Abstract】Objective To establish an analytical method of DNA extracted from human celloidin-embedded temporal bone sections by molecular biologic technique. MethodsPolymerase chain reaction (PCR) with different primers,special amplification methods or coorperated with enzyme restricted reactions was adapted to detect several types of genetic mutations from 9 human celloidin-embedded temporal bone sections. The pGEM-T vector was used for the recombination and cloning of the amplified DNA fragment. ResultsThe 135 bp fragments of normal mtDNA were detected from all of the 9 cases. The 316bp fragment related to mtDNA 4977bp deletion was also detected in two cases who suffered from presbycusis before death by the nested PCR.The result of sequencing confirmed the accuracy of PCR. ConclusionThe application of molecular biologic techniques in temporal bone research is important in improving the quality and value of retrospective study of ear diseases and has resulted in findings of the relevant mutant or pathogenetic genes in the ear diseases such as presbycusis, ototoxic deafness, otosclerosis and viral infections of the ear.

【Key words】Temporal bone DNA,mitochondrial DNA,recombinant Polymerase chain reaction

探索并建立从长期储存的颞骨火棉胶切片中提取线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的方法，应用多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增线粒体DNA片段，建立巢式PCR( nested PCR)方法检测极微量的线粒体DNA大片段缺失，并将所得片段进行重组、克隆、测序，以便研究线粒体DNA突变与听力疾病的关系。

材料与方法

一、标本来源

标本均取自本所颞骨库，颞骨采集时间为死后24～48 h，10%甲醛固定，10%甲酸脱钙，常规火棉胶包埋，连续切片，片厚20 μm，每5片切片中取一片作HE染色，其余切片保存于乙醇甘油（等量混匀）保存液中。标本取自7例患者，年龄8～84岁，死亡日期为1979年1月～1984年10月。2例包含双侧颞骨切片，余均为单侧切片，共9份样品。

二、颞骨切片内DNA提取

取经过耳蜗中轴，包含Corti器、螺旋神经节、囊斑、Scarpa神经节的未染色切片各两片，浸入乙醚及无水乙醇各20 ml的平皿中30 min，剪碎切片，置于离心管，三蒸水冲洗，离心（10 000 r/min) 5 min，弃上清，重复3遍；无水乙醇洗1遍，真空干燥；每管加入600 μL消化缓冲液［100 mmol/L氯化钠，10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）， 0.5% 十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）， 25 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）， pH 8.0］和32 μL蛋白酶K（10 g/L），轻轻振摇，50 ℃水浴24 h；酚、酚氯仿、氯仿抽提纯化核酸，正丁醇浓缩，无水乙醇、乙酸钠沉淀核酸，70%酒精脱盐，Tris-EDTA缓冲液溶解核酸沉淀作为扩增模板备用。

三、PCR扩增

引物（P）1～5按寡核苷酸引物设计原则自行设计，P6、P7由袁慧军等^［1］设计合成，其核苷酸序列如下：

P1：（nt8292～8312）5'-GCCCACTGTAAAGCTAACTTA-3'

P2：（nt13450～13469）5'-TCCCTCACCATTGGCAGCCT-3'

P3：（nt13584～13564）5'-GGTAGCGATGAGAGTAATAGA-3'

P4：（nt8251～8270）5'-GCCCGTATTTACCCTATAGC-3'

P5：（nt13845～13826）5'-GTCTAGGGCTGTTAGAAGTC-3'

P6：（nt1428～1448）5'-GCAGTAAACTAAGAGTAGAGT-3'

P7：（nt1890～1871）5'-GGCTCTCCTTGCAAAGTTAT-3'

引物对2、3及引物对6、7可以扩增mtDNA的135bp（nt13450-13584）及463bp(nt1428-nt1890)片段，引物对4、5及引物对1、3均位于mtDNA⁴⁹⁷⁷的两侧(图1)。若模板中存在mtDNA⁴⁹⁷⁷，在PCR中应用较短的延伸时间， P4、P5可获得618bp片段，P1、P3可获得316bp片段，若无缺失存在，因较短的延伸时间不足以合成大于5kb的片段，将无片段产生。为提高检测的敏感度，可用巢式PCR（P4、P5为外套，P1、P3为内套）来检测mtDNA⁴⁹⁷⁷大片段缺失，若此缺失存在，最终可得到316bp的扩增产物。

正常mtDNA的P4、P5及P1、P3之间相距均超过5kb，常规PCR不能形成条带；发生4977bp缺失后，P4、P5及P1、P3可分别扩增618bp及316bp片段，两对引物可用于巢式PCR

图1检测mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失的引物位置示意

PCR反应体系包括模板20 μL， 10×dNTP 5 μL， 10×Buffer 5 μL， 引物各50 ng，加三蒸水至50 μL，95 ℃变性5 min，冰浴冷却，加Taq酶1、2U，置Ericomp PCR液相仪扩增。扩增条件：变性94 ℃ 1 min，退火58 ℃ 1 min(P6、P7的退火温度为50 ℃)，延伸72 ℃1 min，共循环30次。扩增产物以凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳鉴定。

四、PCR片段与质粒重组

取得100～200ng PCR扩增片段，以低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法纯化，T4连接酶连接PCR片段与质粒pGEM-T Easy Vector（Promega，美国），转化至感受态大肠杆菌DH5α，37℃摇菌1h，取不同菌量铺平板培养基（含氨苄青霉素、IPTG、X-gal），质粒带有氨苄青霉素抗性基因，PCR片段插入位点位于β-内酰胺酶基因之中，形成蓝白斑筛选系统，倒置约16 h，挑取白色菌落置于含氨苄青霉素的培养液中，摇菌10 h。常规法小量质粒提取，EcoR I(华美)酶切鉴定。

五、测序

培养含pGEM-T Easy Vector重组子的DH5α菌至对数期，用QIAprep SpinPlasmid Kit（Qiagen，德国）试剂盒提取纯化质粒，琼脂糖凝胶电泳及EcoR I酶切证实无RNA及存在插入片段，取5 mg纯化质粒送赛百盛公司进行自动测序。

结果

一、颞骨切片内正常mtDNA片段的扩增

引物对P2、P3扩增mtDNA135bp(nt13450-13564）片段，本实验从9侧颞骨切片的DNA提取液中均扩增出135bp片段，其中6侧一次扩增反应后产物经1%琼脂糖电泳即可见明亮的135bp大小条带；3侧一次扩增反应后无相应条带，取扩增产物10 μL作为模板，以相同条件再次PCR(30次循环)，其产物经1%琼脂糖电泳均可见清晰的135bp条带。引物对P6、P7可扩增mtDNA 463bp（nt1428-1890）片段，颞骨切片的mtDNA的短片段扩增效率高于长片段扩增，其一次PCR成功率高于长片段扩增；切片质量如组织形态好坏及细胞自溶程度不影响切片内mtDNA的提取与扩增结果（图2）。

二、PCR法检测颞骨切片内mtDNA突变

以P1、P3作1次PCR扩增9侧颞骨切片DNA提取液均无核酸条带可见，取产物作第二次PCR，则（4侧）有377bp大小的非特异扩增带，以P4、P5作1次PCR亦无核酸条带可见，2次PCR（6侧）可见4、5条非特异扩增带，无法判定有无4977bp的缺失存在。而应用巢式PCR方法，即先以P4、P5作1次PCR，取产物10 μL作模板，以P1、P3再作1次PCR，结果自2例老年性聋患者的颞骨切片（各查1侧）DNA提取液中可获得单一的316bp扩增带，无非特异性扩增带干扰结果的判读。

1 PCR标记物 (1543、994、695、515、377、237bp)；a2～a4 3侧颞骨mtDNA 135bp扩增片段；b2 颞骨模板2次扩增mtDNA 463bp片段；b3、b4 颞骨模板1次扩增无结果；b5 阴性对照；b6 白细胞粗提模板mtDNA 463bp扩增片段

图2颞骨mtDNA扩增片段

三、扩增片段克隆及测序

在上述316bp的纯化片段与质粒pGEM-T Easy Vector连接反应后，以蓝白斑筛选系统培养获得70%～80%的白色菌斑，提取的重组质粒在用EcoR I酶切后可获得略大于316bp的片段，证实316bp PCR片段已重<