【摘要】目的了解谷氨酸钠致单离培养的小鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤后，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对其生存及生长的影响，以及二者对细胞内游离钙离子浓度的影响。方法在培养液中加入2×10^-2mol/L的谷氨酸钠2小时后，实验组分别换成含bFGF 25、50、100 μg/L的培养液，对照组加空白培养液。结果24小时后可见部分细胞裂解、死亡，对照组明显多于实验组。培养14天后甲苯胺蓝染色证实，实验组的细胞生存数及细胞突起长度明显高于对照组，差异有显著性（F检验，P＜0.01），且随着bFGF浓度增加，细胞生存数及细胞突起长度均增加，不同浓度实验组间差异有显著性（P＜0.01）。用Fluo-3染色，激光扫描共聚焦显微镜观察10个螺旋神经节细胞，培养液中加入谷氨酸钠后细胞内钙离子浓度迅速上升，在10～15秒内达峰值，100秒左右恢复到正常水平；加入bFGF后细胞内钙离子浓度无明显变化（t检验，P=0.204）。结论谷氨酸钠可致螺旋神经节细胞内钙离子浓度升高，bFGF可以降低谷氨酸钠对螺旋神经节细胞的细胞毒性。

Effect of basic fibroblast growth factor on cultured spiral ganglion cells following glutamate treatment Wang Dajun,Han Dongyi,Yang Weiyan,et al. Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo understand the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on survival and neurogenesis of the cultured spiral ganglion cell (SGC) of mouse after exposed to glutamate, and the effects of bFGF and glutamate on free intracellular calcium ion concentration. MethodsAfter exposed to 2×10^-2 mol/L glutamate for 2 hours , the medium of SGC was replaced with the media containing 25，50, 100μg/L bFGF. Medium without bFGF was used as control. Results Twenty-four hours later, more cells in the control group showed signs of cell death than in bFGF groups. After 14 days, specimens were fixed in 4% paraformaldehyde and stained with toluidine blue. It was shown that the SGC in medium with bFGF exhibited more survival and longer neurites, and the effect was dose dependent (P＜0.01). Application of glutamate to the medium induced an increase to the the free intracellular calcium ion concentration in SGC, but bFGF had no such effect. ConclusionGlutamate excitotoxicity was associated with free intracellular calcium ion concentration elevation in SGC, and bFGF could protect SGC against glutamate neurotoxicity.

【Key words】 Cochlea Spiral ganglion Fibroblast growth factor,basic Sodium glutamate

谷氨酸钠是目前最受推崇的耳蜗传入神经递质之一。但近来研究表明，谷氨酸钠对中枢和外周的多种神经细胞又有兴奋性细胞毒性作用。文献提示，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)对多种神经细胞有营养和保护作用^［1］，它可以削弱谷氨酸钠对多种神经细胞的兴奋性细胞毒性作用^［2］，但能否降低谷氨酸钠对耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell，SGC)的毒性作用，尚未见报道。本实验观察谷氨酸钠对单离培养的耳蜗螺旋神经节细胞致伤后，bFGF对耳蜗螺旋神经节细胞的生存及生长的影响，同时观察了bFGF和谷氨酸钠对静息状态下的耳蜗螺旋神经节细胞内钙离子浓度的影响，旨在从细胞生物学水平，为进一步阐明谷氨酸钠对听神经细胞毒性的作用机理提供实验依据。

材料和方法

一、bFGF对谷氨酸钠细胞毒性作用的影响

细胞培养采用Lefebvre等^［2］1991年报告的方法。用新生1～5天的NIH鼠4只，雌雄不限。动物引颈处死后在无菌Hank液中取出耳蜗，在立体解剖显微镜下分离出Rosenthol管所在部分的蜗轴。将其放入含有0.25%胰酶(Sigma，美国)和0.25%胶原酶(Sigma，美国)等量混合的消化液中，在37℃下孵育25分钟后，加入含胎牛血清的培养液终止消化作用。然后用Hank液冲洗两遍，加入培养液(低限量eagle培养基 90 ml，葡萄糖0.6 g，NaHCO₃ 0.22 g)，胎牛血清 10～4 ml。用吸管轻轻吹打2～3分钟，使细胞分散均匀，放入37℃的5% CO₂温箱中静置4小时，取细胞悬液中的螺旋神经节细胞以1×10⁸/L的细胞密度接种到涂覆鼠尾胶原的96孔培养板(Sigma，美国)中。分对照组和3个实验组，每组8孔，共32孔,每孔1×10^-4L，浓度控制在1×10⁸/L。在37℃的5%CO₂温箱中培养24小时后，加入含2×10^-2mol/L谷氨酸钠(Sigma，美国)的培养液。作用2小时后，对照组加不含bFGF（Sigma，美国）的培养液，3个实验组分别加入含bFGF 25、50、100 μg/L的培养液，以后每3天换液一次。培养14天后，用4%多聚甲醛溶液固定，以1%甲苯胺蓝染色，光镜下观察，每皿以中央为中心取上、中、下3个视野计数细胞的生存数，在目镜测微尺下测量所有细胞突起的长度^［2］。培养过程中细胞贴壁生长，若活力差则贴壁能力下降，漂浮在培养液中，最后死亡裂解。因此活力下降的细胞在固定及染色的过程中被冲洗掉。

二、bFGF和谷氨酸钠对静息状态下的螺旋神经节细胞钙离子浓度的影响

用新生1～5天的NIH小鼠3只，雌雄不限，每只2耳为一组。细胞培养方法同前。培养14天后，在倒置显微镜下观察，选择生长良好，细胞数较多的孔进行实验。

活性鉴定：在倒置显微镜下，细胞形态呈典型的椭圆形，突起细长，起始部窄。细胞双折射现象存在，细胞核居中，细胞内无布朗运动的颗粒。

1.Fluo-3染色：Fluo-3AM(molecular probe，美国) 用纯二甲基亚砜(DMSO，Fluka，美国)配成1×10^-3mol/L贮备液，低温保存备用。非离子型多元醇表面活性剂Pluronic F-127 以25%(W/V)溶于纯DMSO中备用。实验前将Fluo-3AM与Pluronic F-127贮备液分别以4∶3体积比混于培养液中，终浓度为2×10^-6mol/L。在37℃的5%CO₂温箱中避光孵育30分钟，用Hank液冲洗3次即可观察。

2.激光扫描共聚焦显微镜观察：本实验用ACAS Ultima 型激光扫描共聚焦显微镜(LSCM,Meridian，美国)。LSCM观察用Fluo-3AM染色的培养螺旋神经节细胞内钙离子浓度变化时，荧光强度发生变化，可记录到不同时间内的螺旋神经节细胞内钙离子浓度的变化。本实验用20倍物镜，线扫描方式荧光图像由冷电荷耦合器件(cCCD)摄像机记录，经模-数转换存储于计算机内，每5秒记录荧光图像一次。

3. 数据处理：LSCM所配计算机存储下的荧光图像，由Meridian公司提供的配套软件计算荧光强度值，并绘制荧光强度随时间变化的曲线，记录给药前和给药后300秒内荧光强度的峰值，将其数据进行配对t检验。Fluo-3的钙离子解离常数在0.37～2.3×10^-6mol/L之间，适用于测量较高浓度的钙离子。Fluo-3与钙离子结合后荧光强度增加40倍，但发射光的波长仅轻微改变，故未经校正不能计算钙离子浓度的绝对值。本实验只记录荧光强度的相对值，以观察钙离子浓度的动态变化。因细胞突起较细，很难显影，故本实验仅记录和观察胞体内钙离子浓度的变化。

结果

一、bFGF对谷氨酸钠作用后的耳蜗螺旋神经节细胞生存率的影响

培养液中加入谷氨酸钠24小时后，耳蜗螺旋神经节细胞的生长明显受抑制，部分细胞裂解死亡，漂浮在培养液中。加入bFGF组的细胞死亡明显低于对照组，且随bFGF的浓度增加其效果更明显。对照组与实验组之间（F检验，F=45.58，P＜0.01）及不同浓度的实验组之间(F=7.15，P＜0.01)的差异有显著性，如图1所示。细胞生长情况见图2～5。

图1bFGF 对谷氨酸钠作用后螺旋神经节细胞生存率的影响

二、bFGF对谷氨酸钠作用后螺旋神经节细胞突起生长的影响

培养液中加入bFGF后细胞突起长度较对照组明显增加，对照组及25、50、100 μg/L 3个浓度实验组细胞突起长度（±s μm）分别为：101.6±33.3（31个细胞）、120±31.6（75个细胞）、146.2±34.1（93个细胞）、161.9±31.3（105个细胞），bFGF的浓度越高，效果越明显（F检验，实验组与对照间F=27.73, P＜0.01；不同浓度bFGF组之间F=15.56,P＜0.01）。

三、谷氨酸钠对耳蜗螺旋神经节细胞内钙离子浓度的影响

培养液中加入1×10^-4mol/L的谷氨酸钠后，螺旋神经节细胞内钙离子浓度立即上升，在10～15秒内达峰值，100秒左右恢复到原始水平。本实验观察了10个细胞，其中有3个细胞呈阴性反应。结果示耳蜗螺旋神经节细胞内钙离子浓度在谷氨酸钠加入前与加入后之间差异有显著性(卡方检验，χ²=6.125，P＜0.05)。

四、bFGF对耳蜗螺旋神经节细胞内钙离子浓度的影响

耳蜗螺旋神经节细胞的荧光值在细胞个体之间差异较大，但经