【摘要】目的比较雏鸡和哺乳动物耳蜗生理功能的异同。 过去已有哺乳动物耳蜗及前庭神经元中一氧化氮合酶（NOS）活动证据的报道，其所释放的一氧化氮(NO)在听觉和平衡活动中可能发挥重要作用。方法用经化学修饰的碳纤维微电极，定性检测雏鸡离体耳蜗神经元在不同激动剂的诱发下所释放的NO。根据电极所检测的电流变化的幅度和持续时间判断NO的释放。结果由激动剂乙酰胆碱和L-精氨酸所诱发的NO释放反应幅度相似，但乙酰胆碱的高电流持续时间较短，而ATP所致者幅度大，持续时间长。预加NG-硝基-L-精氨酸，再加上述激动剂，电流无变化。结论雏鸡耳蜗神经元细胞中存在NOS。

Study on nitric oxide in isolated cochlear neuron of chicken with chemically modified carbon fiber microelectrode

Yang Jun, Wang Jibao ,Li Zhiwang. Union Hospital,

Tongji Medical University,Wuhan 430022

【Abstract】ObjectiveNitric oxide(NO) is involved in neural signaling that is important to the physiologic and pathophysiologic activities of cochlea and vestibule. This study is to compare physiologic function of mammalian cochlea with that of chicken cochlea.MethodsUsing chemically modified carbon fiber microelectrode to measure qualitatively NO which was released from isolated cochlear neuron cluster of chicken in response to certain agonists, such as ATP,L-Arg and ACh. The presence of NO release is indicated by elevation of amplitude and lasting time of microelectric current.ResultsThe results demonstrated that NO releases stimulated by ACh and L-Arg were similar in amplitude but the lasting time stimulated by ACh was shorter than that of L-Aeg. Response to ATP, however, differred apparently in a manner which the amplitude was larger than that of ACh and L-Arg, whereas the lasting time approximated to that of L-Arg but longer than that of ACh. Before application of agonists, preapplication of L-NNA ,a NOS antagonist no current changes could be monitored.ConclusionThese data suggested that chicken cochlear ganglion can synthesize and release NO. The effective mechanism of the agonists and possible role of NO in the cochlea is discussed.

【Key words】Nitric oxide Neurotransmitters Cochlea Neurons Chickens

一氧化氮（NO）是自然界中最小的自由基气体分子。最初认为是由血管的内皮细胞和平滑肌细胞释放的内源性血管舒张因子。其前体为L-精氨酸(L-Arginine)，在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）作用下释放出NO。后来发现NO的作用非常广泛，例如在中枢神经系统中为神经递质，参与周围神经的冲动传递、学习记忆、免疫反应等。最近发现前庭系统中有NO的活动^［1］，Fessenden等^［2］发现，耳蜗神经元中有NOS存在。我们利用经化学修饰的碳纤维微电极定性检测离体耳蜗神经元在激动剂诱发下所释放的NO，现报道如下。

材料与方法

一、仪器与试剂

1.主要仪器：工作电极为碳纤维微电极(axon tip ultramicroelectrode，AXON，美国），对电极为铂丝电极(Bas，美国)，参比电极为饱和甘汞电极232 型Q/YXDG16-91(上海电光器件厂)。微电流记录仪Autoranging picoammeter 485（Keithley,美国)。恒电位仪 Bi-Potentiostat Model Afrde 5(PINE，美国)。台式电流记录仪 Type 3086 X-Y Recoder(Yokokawa Hokuhin Electric，日本)。

2.液体与试剂：D-Hank液（g/L:NaCl 8.0，KCl 0.2，Na₂HPO₄*H₂O 1.15， KH₂PO₄ 0.2)pH 7.4，300 Osmmol/L。 细胞外液［g/L: NaCl 10.0，KCl 0.4， CaCl₂ 0.6，MgCl₂ 0.2，葡萄糖 1.4，N-2-羟乙基哌嗪-N＇-2＇-乙烷磺酸(HEPES) 1.2］ pH 7.2，300 Osmmol/L。三磷酸腺苷（ATP,Sigma,美国), N^G-硝基-L-精氨酸（N^G-nitro-L-arginine,L-NNA,Aldrich，美国),乙酰胆碱（中国军事医学科学院),L-精氨酸（Sigma，美国)。所用试剂均用含Ca²⁺的细胞外液配制。

二、实验动物及样本制备

选用发育正常的2～3周龄雏鸡(ISA,武汉市种鸡场提供)20只,雌雄不限。快速将动物断头，矢状面剖开鸡头，修剪颅骨除去多余的骨质，保留颞骨，挑开鼓膜及耳柱器，置于D-Hank液中。在解剖显微镜下，取出双侧耳蜗管，完全除去血管盖及远端的耳石器，用细尖针将含毛细胞的基底乳头从上纤维软骨板上离断。上纤维软骨板移至另一小皿（直径35 mm）中，用尖针将其分解成小碎片，在倒置显微镜下观察，耳蜗神经节细胞成团分布，每团所含细胞数量不等。所用耳蜗神经元均为鸡断头3小时之内。实验在室温（25～30℃）下进行。

三、微电流记录系统组成、工作原理及过程

整个系统由传统三电极（工作电极、对电极和参比电极）体系与恒电位仪、微电流记录仪组成。工作电极（尖端直径5 μm)经循环伏安法进行化学修饰,以提供一个膜,通过恒电位仪对工作电极和参比电极之间施加固定电位(0.8V)，在修饰膜表面NO被催化，形成氧化电流，由微电流记录仪显示并由台式记录仪记录出来。微电流记录灵敏度达到pA级。

在参比溶液(饱和KCl溶液)与工作溶液(D-Hank液)间采用了琼脂盐桥，以使由于离子扩散越过接界面而形成的液接电界电位降到低值。

实验时，将修饰过的碳纤维微电极尖端靠近耳蜗神经节细胞团(距离＜10 μm)，快速加药装置的排药管置于另一侧。

结果

1.空白对照：在不含细胞的D-Hank液中分别加入ATP(10^-4mol/L)、乙酰胆碱(10^-3mol/L)、或L-精氨酸(10^-4mol/L)时，无电流改变，说明刺激药物对NO的氧化电流不产生干扰性的影响。

2.激动剂刺激: 每一激动剂促使细胞释放NO的实验均在不同培养皿中的细胞团上施行，以防止激动剂弥散后对同一培养皿中其他细胞产生刺激作用而影响实验结果。实验中尽量选择所含细胞数量相近的细胞团（40～50个）进行检测，以便进行激动剂效应之间的比较。激动剂为：ATP、L-精氨酸和乙酰胆碱。

加入10^-4mol/L的ATP 10秒，电流平均值（±s pA, n=10,n为耳蜗神经元细胞团数,下同）从基线水平（200.0±6.5pA，)迅速上升，10秒内达到峰值（270.5±8.5pA ），然后缓慢下降，约14分钟后回到基线水平（图1A）。

图1A 10^-4mol/L ATP诱发耳蜗神经元细胞团释放NO的时间/电流反应曲线。B预加10^-4mol/L L-NNA 10秒后再加ATP（10^-4mol/L），无电流反应

L-精氨酸为NO前体物，加入10^-4mol/L的L-精氨酸10秒后微电极在10秒内响应，迅速升至最大值（由基线10.0±4.8pA，升至42±5.8pA，n=8），然后缓慢下降，约13分钟后回到基线水平（图2A）。回到基线后重复加入等量的L-精氨酸，可以重现前述的结果。加入10^-3mol/L乙酰胆碱10秒，电极响应时间＜10秒，电流升高的幅度(31.9±4.3pA,n=12)与L-精氨酸所致者相似，但高电流持时间短，8分钟后即回到基线水平（图3）。

图2A 10^-4mol/L L-精氨酸诱发耳蜗神经元细胞团释放NO的时间/电流反应曲线。B预加10^-4mol/L L-NNA 10秒后再加L-精氨酸（10^-4mol/L），无电流反应

图3A 10^-3mol/L 乙酰胆碱诱发耳蜗神经元细胞团释放NO的时间/电流反应曲线

加入10^-4mol/L ATP，电流幅值增加，3.5分钟后就同一细胞团加入10^-4mol/L L-精氨酸，电流在ATP幅值水平上继续升高（图4）。

图4加入ATP（10^-4mol/L）微电极所感应的NO氧化电流幅值升高，3.5分钟后加入L-精氨酸（10^-4mol/L），电流在此幅值上继续升至高值

绘出电极工作曲线，可看出这种化学修饰电极所感应的电流相对于细胞释放的NO呈线性增加。

3.NOS抑制剂: L-N