【摘要】目的考察1555^G点突变与氨基糖甙类抗生素致聋的对应关系，建立相应的基因诊断方法提供依据。方法收集了3个有明确氨基糖甙类抗生素应用史的母系遗传耳聋家系13人（包括聋人和听力正常者）的外周静脉血标本，聚合酶链反应扩增线粒体DNA，Alw26 I限制性内切酶分析、DNA斑点杂交和DNA序列分析检测1555^G点突变。结果家系1和3的7份样品均为1555^G点突变阳性，家系2的6份样品为 1555^G点突变阴性。结论发现1个1555^G点突变阴性的氨基糖甙类抗生素致聋家系，说明线粒体DNA 1555^G点突变不是氨基糖甙类抗生素遗传易感性唯一的分子基础。

Screening for the 1555^G mutation in mitochondrial DNA in pedigrees

with aminoglycoside antibiotic induced deafness

Yuan Huijun , Jiang Sichang , Yang Weiyan , et al. PLA General Hospital , Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo identify the relationship between the 1555^G mutation in mitochondrial DNA and aminoglycoside antibiotic induced deafness and provide theoretical evidence for establishing diagnostic method.Methods Blood samples were obtained from three pedigrees with aminoglycoside antibiotic induced deafness. DNA was extracted from the isolated leukocytes. The mitochondrial DNA fragments were amplified by PCR, 1555^G mutation was detected by Alw26 I restriction endonuclease digestion，allele-specific oligonucleotide hybridization and DNA sequencing.ResultsSeven individuals from pedigrees A and C carried homoplasmic 1555^G mutation, six individuals from pedigree B did not have 1555^G mutation.Conclusion1555^G mutation is not the only pathologic mitochondrial DNA mutation associated with aminoglycoside antibiotic induced deafness. This is the first finding of aminoglycoside antibiotic induced deafness pedigree without 1555^G mutation.

【Key words】Hearing disorders DNA,Mitochondrial Gene Genetics,biochemical

Antibiotics,aminoglycoside

氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotics, AmAn)具有严重的耳毒性副作用，可使患者发生不可逆转的听力损失。近年来研究发现部分患者有母系遗传家族史^［1］，并与线粒体DNA(mitochondrial DNA, mt DNA) 12S rRNA基因第1555 位A→G均质性点突变有关^［2］。 空间结构分析和细胞生物学研究进一步证实了1555^G点突变在氨基糖甙类抗生素致聋（aminoglycoside antibiotic induced deafness,AAID）病因学上的重要作用^［3］。1555^G点突变的检出为临床医生预测AmAn个体敏感性提供了可能性，1555^G点突变阳性个体本人及其母系亲属应避免接触AmAn^［4］。但目前分子遗传学研究还不清楚1555^G点突变是否为AmAn致聋患者发病的唯一机理, 1555^G阴性者并不能排除对AmAn耳毒性高度敏感的可能性。本研究目的是考察1555^G点突变与AmAn致聋的对应关系，并寻找与此种聋病相关的其它突变位点，为建立相应的基因诊断方法提供依据。

本研究收集3个AAID易感家系，对患者及其母系家族成员的线粒体DNA进行1555^G点突变分析，报道1个1555^G点突变阴性的母系遗传AAID家系。

材料与方法

一、临床资料

家系1(图1A)先证者Ⅳ23，女，山东籍，半岁时因肺炎注射硫酸链霉素4天，5个多月后出现听力下降。该家系健在的3代54人中18人有AmAn应用史，其中女性后代有15人在用药15天至5个月后都出现了不同程度的听力下降，男性后代有3人(Ⅲ7、 Ⅲ8、Ⅲ9 ) 有AmAn应用史，听力正常。

家系2(图1B)先证者Ⅲ4 ，女，湖南籍，7岁时因扁桃体炎注射庆大霉素约1周，1～2个月后听力开始下降。纯音测听双耳言语平均听阈为60～70 dB HL，高频听力损害严重。其母及3个同胞兄长均为耳聋患者，且有明确的AmAn应用史。2个姨表兄也发现有耳聋，用药史不详。

家系3(图1C)先证者Ⅲ5，男，安徽籍，因感冒诱发左耳聋，高频听力下降明显，治疗10天后逐渐恢复。其兄在20岁时因注射了一次庆大霉素而出现听力下降，其妹1岁左右因患白喉注射了双氢链霉素，以后发展为双耳全聋。Ⅲ1为男性后代耳聋患者，耳聋原因不明，是否用过AmAn不详。

A 家系1B 家系2C 家系3

图13个家系遗传图谱

二、方法

1. DNA提取：分别取家系1的 Ⅱ4 、 Ⅲ4 、 Ⅲ13、 Ⅳ6、Ⅳ23、Ⅳ24、家系2的 Ⅱ1 、 Ⅲ1 、 Ⅲ2 、 Ⅲ3 、 Ⅲ4 、Ⅳ3 (家系1的Ⅲ13、Ⅳ24和家系2的Ⅳ3为听力正常者，无AmAn应用史)及家系3的Ⅲ5共13份外周静脉血各2～3 ml ( 冰浴保存，24小时内抽提DNA)，自然分层后在血浆与血球交界处吸取200 μl富含白细胞的血球，加20倍体积的三蒸水，置冰浴10分钟后8 000 r/min离心5分钟，弃上清液，细胞沉淀用400 μl 三蒸水重悬，100℃煮沸15分钟使细胞破裂，12 000 r/min离心10分钟，上清液即可作为聚合酶链反应的模板^［5］。

2. mtDNA 小片段的聚合酶链反应扩增：以mtDNA寡核苷酸 (nt)1428～1448及(nt)1890～1871为引物，以患者外周血白细胞粗提DNA为模板扩增mtDNA (nt)1428～1890基因片段。聚合酶链反应条件：94℃1分钟，50℃1分钟，72℃40秒，共30个循环。以1％琼脂糖水平凝胶电泳观察聚合酶链反应结果。

3. Alw26 I 酶切：取聚合酶链反应产物10～20μl，以Alw26 I 37℃酶切1小时，1％琼脂糖水平凝胶电泳观察酶切结果。

4. 寡核苷酸探针的合成及标记：设计并合成一对长度为15 bp的寡核苷酸探针，与mtDNA (nt) 1548～1562序列一致，A探针序列为AGA GGA GAC AAG TCG，与野生型mtDNA序列一致，G探针序列为AGA GGA GGC AAG TCG，与1555^G突变型mtDNA序列一致。合成探针时直接将生物素标记于探针的3′端。

5. 斑点杂交：取2 μg 聚合酶链反应扩增产物用负压抽滤式斑点杂交点样器将样品点于硝酸纤维素膜上，相同的样品点两张膜。加入预杂交液 ［5×氯化钠-柠檬酸钠溶液(5×SSC)，1×FPG（50×FPG: 1%聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%甘氨酸，过滤除菌），25 mmol/L磷酸缓冲液pH7.0，0.2%十二烷基磺酸钠，5%聚乙二醇(分子量6 000)，100 μg/ml 变性鲑精DNA］，37℃水浴预杂交4小时。室温下杂交36小时（杂交液为预杂交液中加入终浓度为10 ng / ml的寡核苷酸探针A或G)。洗膜后用3％牛血清白蛋白37℃封闭膜2小时，以亲和素-碱性磷酸酶显色系统(军事医学科学院放射医学研究所，方法见试剂盒说明) 显色。

6. mtDNA序列分析： 将mtDNA 聚合酶链反应扩增产物用低熔点琼脂糖凝胶纯化后与pUC19载体连接，转化E. coli JM109菌株，EcoR I / Hind III双酶切鉴定阳性重组子, 送赛百盛公司进行自动测序。

结果

1. mtDNA (nt) 1428～1890基因片段的聚合酶链反应扩增：依据聚合酶链反应引物设计的若干原则设计合成了一对引物，P1：GCA GTA AAC TAA GAG TAG AGT；P2：GGC TCT CCT TGC AAA GTT AT。分别与mtDNA 12S rRNA基因 (nt) 1428～1448及 (nt) 1890～1871完全配对，解链温度(Tm)值均为58℃，计算机检索无发夹结构及引物二聚体形成。

聚合酶链反应结束后经电泳鉴定，在515 bp和377 bp之间有一条清晰DNA条带，即463bp目的DNA片段，未见非特异性扩增的DNA杂带(图2)。

2. Alw26 I限制性内切酶分析：1555^G点突变使原来存在的Alw26 I酶切位点消失，聚合酶链反应扩增的目的片段如含有1555^G突变，用Alw26 I内切酶切割时仍为463bp一条带，而无此突变的扩增片段则被切割成339bp和124bp两条带。

家系2所有样品均出现463bp、339bp和124bp 3条带(图3)，1555^G突变阴性。家系1及3的样品酶切后仅见4636bp 1条带，1555^G突变阳性, 作为阴性对照的健康人样品为463bp、339bp和124bp 3条带(图4)。

3. 斑点杂交：以A探针杂交者，家系2的4名成员及1名作为对照的健康人为阳性，家系1的2名成员及家系3的1名成员为阴性。以G探针杂交者，家系2的4名成员及1例作为对照的健康人为阴性，家系1的2名成员及家系3的1名成员为阳性。与Alw26 I酶切分析结果吻合。斑点杂交未发现胞质异质性现象(图5)。

4. mtDNA序列分析： 测序结果提示家系2的1555位为A，无1555^G点突变，家系3的1555位为G，1555^G点突<