oocytes by messenger RNA from rat cochlear nucleus

yang Weiping, Jiang Sichang, Yang Weiyan, et al

【摘要】 目的 研究在爪蟾卵母细胞中表达的大鼠耳蜗核电压依赖性离子通道的特性，为揭示感音神经性聋听觉中枢离子通道的变化奠定方法学基础。方法 采用异硫氰酸胍-苯酚氯仿法和美国新磁珠技术，从50只大鼠耳蜗核提取多聚腺嘌呤mRNA，注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的离子通道，并利用电压钳方法记录电压依赖性的离子通道电流。结果 在注射大鼠耳蜗核mRNA的16个卵母细胞膜上记录到电压依赖性的瞬间外向型钾离子通道电流，其电流最大幅度的平均值为364±42 nA 。结论 本实验建立的模型在听觉中枢的生理、病理及药理学研究中起到一定的作用。

Study on the methodolgy of potassium channel expression in Xenopus oocytes bymessenger RNA from rat cochlear nucleus Yang Weiping, Jiang Sichang, Yang weiyan,et al. PLA General Hospital, Beijing 100853

【Abstract】 Objective To study the properties of voltage-dependent ion channels

expressed in Xenopus oocytes by mRNA from rat cochlear nucleus and to lay a methodological foundation for studying the changes of ion channels in auditory centre with sensorineural hearing loss.Methods Poly (A)⁺ mRNAs isolated from the rat cochlear nucleus by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) method and Promega′s new magnesphere technique were microinjected into Xenopus laevis oocytes to express functional ion channels. Voltage clamp technique was used to record the current of voltage-dependent ion channels.Results A voltage-dependent ion channel was detected from oocytes injected with rat cochlear nucleus mRNA. The maximum amplitude of the outward current was 364±42 nA (n=16). It was identified

as transient outward potassium channel .Conclusion The model set up by the test may play an important role in studying the physiology、pathology and pharmacology of auditory centre.

【Key words】 Cochlear nucleus Potassium channels Oocytes RNA,messenger Patch-Clamp techniques

近十余年来，爪蟾卵母细胞已被广泛应用于表达各种受体及离子通道^［1］。我们的实验采用卵母细胞的离子通道移植法与电压钳技术相结合，研究初级听觉中枢离子通道的特性，为探讨其变化与感音神经性聋的发病关系提供理论基础。

材料和方法

一、大鼠耳蜗核组织的取材

成年Wistar大鼠（北京动物饲养中心）50只，2～3月龄,体重130～150 g,雌雄不拘。动物均无强噪声及耳毒性药物使用史，活杀时未发现中耳炎，耳廓反射灵敏。1％戊巴比妥钠腹腔注射(30～40 mg/kg), 麻醉后应用电反应测听仪(日本三荣7S11A型 )检测听性脑干反应 (ABR)阈值。随后动物断头，解剖取脑干组织。大鼠耳蜗核位于延髓上部与脑桥连接处, 同侧绳状体的外侧,小脑绒球的内侧^［2，3］。参照包新民^［4］等编著的大鼠脑立体定位图谱对耳蜗核组织定位,取材。

二、mRNA的分离

采用异硫氰酸胍-苯酚氯仿法和美国Promega新磁珠技术^［5］，自大鼠耳蜗核组织提取多聚腺嘌呤poly (A)⁺ mRNA。UV-365型紫外分光光度计(日本岛津)A_280nm和A_260nm，计算mRNA含量。

三、卵母细胞的制备及微量注射

碎冰麻醉非洲爪蟾（中国科学院发育所 ）5只,腹部切口取卵，于Barth溶液中分离挑选直径1.1～1.2 mm健康的I～VI期卵母细胞50个^［6］，在解剖显微镜下，用改制的微量注射装置，经尖端10 μm的玻璃微管对每个细胞注射50 nL mRNA(1 μg/μL)。将注射卵置于Barth溶液中19～20 ℃孵育48小时。

四、离子通道反应的观察

表达mRNA的卵母细胞置于装有1 ml任氏液的微型浴槽内^［7］，将灌充3 mol/L醋酸钾，尖端内径约1 μm，阻抗2～4 MΩ的玻璃微电极固定在微操纵器上（日本成茂WR-90), 借助显微镜将电极尖端插向细胞膜，电压钳指令电位由EPC-9型膜片钳仪（Heka德国) 产生并记录电流反应，利用M2 LAB分析软件（美国）在Atari MEGA 4微机（美国）上进行数据分析。

结 果

一、大鼠ABR阈值检测

50只大鼠，100只耳数ABR阈值平均为25.60±7.20 dB SPL（±s), 属于正常听阈范围。

二、大鼠耳蜗核poly(A)⁺ mRNA的提取

实验测得100个大鼠耳蜗核提取的poly(A)⁺ mRNA的A_260nm/A_280nm比值为2.0，表明样品中蛋白质基本除净。1 g大鼠耳蜗核组织提取的poly(A)⁺ mRNA为24 μg。

三、 电压依赖性离子通道电流的检测结果

1.爪蟾卵母细胞自身存在的电压依赖性离子通道电流：为排除爪蟾卵母细胞自身存在的内源性离子通道电流对表达的外源性离子通道电流的干扰，首先对未注射mRNA的对照组50个卵母细胞进行内源性离子通道电流的分析。结果发现爪蟾卵母细胞本身基本没有电压依赖性的内向电流, 当电压钳位于-100 mV时,记录到两种电压依赖性的瞬间外向电流。一种有13个卵母细胞，在去极化电位-20 mV时被激活,+10 mV时电流幅度达最大均值为21±5 nA（x±s，以下同),该电流被钙离子拮抗剂10 mmol/L MnCl₂所阻断。根据其电流激活电位接近氯离子平衡电位(-20 ～-25 mV),疑为钙依赖性氯离子电流(I_Cl(Ca))。另一种有16个卵母细胞，在去极化电位-30 mV时被激活, +30 mV时电流幅度达最大均值57±12 nA, 该电流对钾离子阻断剂5 mmol/L四氨基吡啶(4-AP)较为敏感。根据其电流激活较快的特点, 疑为瞬间外向钾离子电流(I_A，图1)。

2. 在注射大鼠耳蜗核mRNA的爪蟾卵母细胞

a 钙依赖性氯离子电流 b瞬间外向钾离子电流

图1 在未注射mRNA的爪蟾卵母细胞膜上记录到的电压依赖性离子通道电流

膜上记录到的电压依赖性离子通道电流：注射大鼠耳蜗核mRNA的16个存活的爪蟾卵母细胞在电压钳位于-100 mV,以10 mV的阶跃给细胞一串去极化的刺激，当去极化达到-30 mV时，细胞开始产生一个时程较长的外向电流，此电流幅度随去极化电压的增大而增高。卵母细胞膜去极化至+30 mV时，外向电流幅度达最大均值为364±42 nA。为确定外向电流的性质，分别在细胞外液中加入终浓度为1μmol/L 的钠离子通道阻断剂河豚毒素(TTX)和10 mmol/L的钙离子阻断剂 MnCl₂,该电流幅度没有变化。当加入终浓度为20 mmol/L的钾离子通道阻断剂氯化四已胺(TEA) 20秒钟后,电流明显减小。TEA撤换后,此电流逐渐恢复(图2)。根据该电流激活阈值较高，上升快速, 失活缓慢，对TEA敏感等特点,疑为I_A（图3）。

A 对照组(胞外为任氏液)

b 实验组 a TTX b MnCl2 c TEA

图2 离子通道阻断剂对注射mRNA的爪蟾卵母细胞膜离子通道电流的作用

讨 论

a 电压依赖性钾电流 b去极化电压刺激的阶跃

图3 在注射大鼠耳蜗核mRNA的爪蟾卵母细胞膜上记录到的电压依赖性钾电流

钾离子通道分为电压依赖性受体、第二信使、配体激活性和Ca²⁺、Na⁺激活性等十几种亚型^［8］。本实验采用电压钳方法, 将细胞膜电位维持在-100 mV,当去极化电位在-30～30 mV时在注射大鼠耳蜗核mRNA的爪蟾卵母细胞膜上记录到一种电压依赖性I_A。其判断依据为:钠、钙和氯离子流在此去极化电位范围通道开放均产生内向膜电流,根据我们记录到膜电流为外向型的特点可以排除以上三种通道电流; 虽然I_Cl(Ca)和钙依赖性钾电流(I_k(Ca))可以产生外向型膜电流, 但前者去极化激活电位为-20～-25 mV,电流幅度最大值出现在+10 mV, 后者去极化激活电位为-50 mV, 电流幅度最大值出现在+50 mV。此外,在细胞外液中加入钙离子阻断剂 MnCl₂和钠离子通道阻断剂TTX后对膜电流没有影响,表明该电流不是由于钙内流激活氯通道或钾通道及钠内流激活钾通道所引起。延迟整流型钾离子通道电流(I_K)和I_A都属于电压依赖性外向型膜电流，前者缓慢激活, 缓慢失活, 后