ated vestibular hair cells in guinea pig

Han Weiju, zhang Suzhen, Jiang Sichang, et al

【摘要】 目的 为探讨温度改变诱发前庭眼震的机理。方法 酶孵育后机械分离成功豚鼠前庭毛细胞(VHC)34个，Fluo-3荧光染色后，改变其外环境的温度，用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)记录静息状态下及温度改变时VHC内钙离子浓度(［Ca²⁺］i)的变化。 结果 将分离的VHC分为两型，LSCM下钙离子分布图像与相差显微镜下所见细胞外形相似，其钙离子分布在核区略高。18/22的Ⅰ型与7/12的Ⅱ型VHC其细胞内［Ca²⁺］i随温度的升高而增加，随温度的降低而减少，呈规律性变化，但I型VHC的变化幅度较大；对照试验观察到变温仅对少数(2/9)耳蜗外毛细胞(OHC)内 ［Ca²⁺］i有影响。本研究结果显示变温对VHC有直接刺激作用，表现为VHC内［Ca²⁺］i变化。结论 对冷热诱发眼震的解释，除Barany的热对流学说外，尚存在冷热对VHC的直接作用。

Thermal influence on intracellular calcium concentration of isolated vestibular

hair cells in guinea pig Han Weiju, Zhang Suzhen, Jiang Sichang, et al. PLA General

hostipal,Beijing 100853

【Abstract】 Objective To further understand the mechanism of caloric test.Methods

vestibular hair cells(VHC) were isolated from guinea pig crista ampullaris by enzymatic

and mechanical methods and the variations of intracellular free calcium ion concencation(［Ca²⁺］i) with changes of the extracellular medium temperature were observed. The

［Ca²⁺］i of VHC was examined using laser scanning confocal microscopy(LSCM) and the Ca²⁺ sensitive dye Fluo-3.Results were as follows: 1. There was an increase in ［Ca²⁺］i of 81.8%(18/22) type I VHC and 7/12 type II VHC with the heat stimulation and a decrease in ［Ca²⁺］i with temperature decrease. The magnitude of variation in ［Ca²⁺］i in type i VHC was larger than that in type II VHC. 2. There was no significant change in ［Ca²⁺］i of outer hair cells (OHC) with the heat stimulation.Conclusion There is a direct thermal influence on vestibular sensory cells and this influence accompany with the variation of ［Ca²⁺］i in vHC.

【Key words】 Hair cells , vestibular Calcium temperature Microscopy, cofocal

冷热试验是临床常用的前庭功能检查方法。对冷热刺激诱发眼震的解释，

barany认为是对流引起的内淋巴运动所致。但在太空的微重力环境中，外耳道冷热刺激仍能诱发出与地面上相同的眼震^［1］，说明在前庭冷热反应中，存在热对流以外的其它机制。冷热刺激可诱发离体前庭毛细胞(VHC)的主动运动^［2］，提示冷热对VHC有直接影响，本实验采用钙敏荧光染色与激光扫描共聚焦显微镜技术，观察冷热刺激对豚鼠离体VHC内钙离子浓度(［Ca²⁺］i)的影响。以探讨冷热诱发眼震的机理。

材料和方法

一、细胞分离与荧光着色

选用耳廓反射正常，体重200～250 g的健康花色豚鼠18只，雌雄兼用。快速断头，取出双侧听泡放入Hank液中，采用酶孵育后机械分离法^［3］，解剖显微镜下分离壶腹嵴，0.25 g/L胶原酶Ⅳ(Sigma公司)室温下(22～24℃)作用20分钟，将壶腹嵴移入经刀豆球蛋白(Sigma公司)处理过的装有Hank液的培养皿中，剪碎，机械吹打分离，制备较多的VHC。6 μmol/L酯化形式的 Fluo-3(Molecularprobe公司)室温下染色40分钟。用Hank液浸洗3次，相差显微镜下选取活性良好的VHC^［3］，进行实验观察。

二、冷热刺激与温度记录

将装有待观察细胞的培养皿置于共聚焦显微镜所配备的孵育箱中，与孵育箱相连的控制面板上有温度调节旋钮，可升降培养皿内液体的温度。温度传感器探头置于待观察细胞的周围，浸于Hank液中距细胞5 mm之内，细胞周围的温度经传感器显示于控制面板的显示屏上，由此可监控细胞外环境的温度。为防止变温过程中因蒸发出现渗透浓度改变，采取以下措施：①封闭培养皿；②培养皿中加入Hank液达4 ml，每隔5分钟更换一次；③实验前后测Hank液渗透浓度，变化超过3 Osmmol/L者剃除。

三、荧光信号的记录

经Fluo-3染色的活性良好的VHC内［Ca²⁺］i改变时，VHC的荧光强度即发生改变，用Ultima型激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，美国Meridian公司)可记录到不同时间和空间VHC的荧光强度，未经校正时虽不能得到［Ca²⁺］i的绝对值，但通过记录荧光强度的变化，可观察到VHC内Ca²⁺的空间分布及变温时VHC内［Ca²⁺］i的变化幅度。

四、溶液

细胞培养液用Hank液，三蒸水配制，主要盐浓度为(单位：mmol/L)：NaCl137，KCl 5.4，CaCl₂ 1.3，MgSO₄ 0.8，Na₂HPO₄ 0.4，KH₂PO₄0.4，D-葡萄糖5.5。用1mmol/L NaOH调节pH至7.4。后用全自动冰点渗透压计(上海第一医科大学)和1mmol/L NaCl测量并调节渗透浓度至300±2 Os mmol/L。

D-Hank液：在Hank液成分基础上，去掉CaCl₂，MgSO₄。

结 果

一、离体VHC的形态及Ca²⁺分布特征

活性良好的VHC表现为：细胞膜光滑完整，细胞体呈烧瓶型、棒状、圆形3种，纤毛束排列有序，细胞质中无明显的布朗运动颗粒，在相差显微镜下细胞膜有良好的双折射现象。随着VHC离体时间的延长，活力逐渐减低，表现为胞质内出现颗粒，细胞膜双折射消失。一般离体的VHC在Hank液中可存活5～6小时，足以完成实验。冷热试验在动物断头后2小时之内均完成。参照Valat^［3］和Scarfone等^［4］的分类方法，将VHC分为两型，Ⅰ型细胞呈烧瓶形，包括圆形含细胞核的基底部，长度不同的细胞颈以及颈末端的皮板和纤毛，Ⅱ型细胞呈圆形或棒状，颈部不明显。静息状态下， Fluo-3荧光染色后，活性良好的VHC呈现明亮的荧光，与周围背景形成鲜明的反差，荧光分布的外形与相差显微镜下所见相符。I型和Ⅱ型VHC细胞核的［Ca²⁺］i均高于细胞质、细胞质内的［Ca²⁺］i高于细胞膜，大部分VHC的纤毛束没有或仅有很弱的荧光着色。在Ⅰ型VHC，表皮板区的［Ca²⁺］i也比较高。图１为静息状态下Fluo-3染色的VHC的Ca²⁺分布图像。

二、冷热刺激对离体VHC内［Ca²⁺］i的影响

在成功观察的22个Ⅰ型VHC中，18个(81.8％)细胞随温度升降，其荧光强度呈规律性的变化，即升温时荧光强度增加，温度恢复时，荧光强度降至略高于静息时的水平，再次升温，荧光强度仍能增加，18个I型VHC荧光强度相对值峰值为1.67±0.20(±s,下同)。变温的初始温度为25℃，变温速度1.0℃／min，变温范围6℃。图2、3显示一个Ⅰ型VHC荧光强度的相对值(各个时间点的荧光强度与初始荧光强度的比值)及温度随时间变化的曲线，以及不同时间点的荧光图像。显示热刺激时［Ca²⁺］i升高、冷刺激时［Ca²⁺］i降低，这种变化可重复。

图2 Ⅰ型VHC荧光强度的相对值及温度变化的曲线

12个Ⅱ型VHC中有7个(58.3％)，其荧光强度随温度的变化与I型VHC相似，但在变温范围与Ⅰ型VHC相同时，其荧光强度的变化幅度较Ⅰ型VHC小，其荧光强度相对值峰值为1.39±0.16(±s),与I型VHC相比，差异有显著性(成组t检验，t=3.356,P〈0.01)，图4显示一个Ⅱ型VHC荧光强度相对值及温度随时间变化的曲线。

三、对照试验

观察了9个耳蜗外毛细胞(OHC) Fluo-3染色后荧光强度随温度的变化，变温参数与实验组相同，但只有少数(2/9) OHC的荧光强度随温度升高而升高。3种内耳毛细胞在变温时［Ca²⁺］i 随温度呈规律性变化(即升温时［Ca²⁺］i升高，降温时［Ca²⁺］i下降)的细胞数及其百分率，χ²检验结果显示I型VHC与OHC的变化差异有显著性(χ²检验，χ²=7.48, P?.01), 而I、II型VHC之间，II型VHC与OHC之间相比，发生［Ca²⁺］i变化的细胞数差异无显著性。将细胞内液与Fluo-3一起孵育40分钟后改变其温度，按上述变温参数，细胞内液的荧光强度不随温度而变化。因此可以除外因荧光染料本身随温度引起的荧光强度的变化。

图4 Ⅱ型VHC荧